|
1)cDNA発現クローニング法を用いてRasの制御因子を探索するため、Phagemid型のcDNA発現ベクベクターλHK2を開発した。このベクターには、cDNAを発現させるためのEF1αプロモーター、cDNAクローニング部位、培養細胞での選択マーカーであるblasticidin耐性遺伝子、大腸菌での選択マーカーであるampicillin耐性遺伝子、プラスミド部分を環状化するのに必要な2つのloxP部位を保持している。このベクターの開発によりより、以下のライブラリーの作製が可能となった。2)ラット脳cDNAライブラリーより、PI-SceIとI-CeuIにより、cDNAを切り出し、λHK2に挿入し、2つのcDNA発現ライブラリーを作製した。平均cDNAサイズはそれぞれ2.0、4.1kbであり、大部分がcDNAを含むことより、以下のトランスフェクション実験が可能となった。3)NIH3T3細胞由来でRasでトランスフォームした細胞株DTに、カルシウム-リン酸共沈法で、ライブラリーDNAをトランスフェクトした。Blasticidinを含む培地で細胞を選別後、コロニーの形態を顕微鏡で観察することにより、リバータントを同定し、コロニーを単離した。一連の実験により700個以上のリバータントを単離した。4)リバータントから、ゲノムDNAを抽出し、Creリコンビナーゼを働かせることにより、トランスフェクトしたcDNAを含むプラスミド部分を環状化し、大腸菌内に回収した。回収したプラスミドを再びDT細胞にトランスフェクトし、リバータント誘導活性があるかどうか検討した。現在、300個以上のリバータントから、約70個のリバータント誘導活性があると思われる遺伝子が同定され、これらの中にはこれまでRasとの関連が報告されていない遺伝子も含まれると考えられる。
|
