| 研究概要 |
本年度において, PITX1のカウンターパートの網羅的探索と機能解析を中心に実施した. DNA転写制御を行うタンパク質は単独で機能するわけではなく, 他のタンパク質との相互作用によって複合体を形成して機能していることから, 機能単位としてはたらくPITX1タンパク質複合体を決定することは, PITX1のテロメレース制御機構を明らかにする上で重要な分子情報を得ることができると考えられる. そこで申請者らは, FLAGを付加したPITX1を安定に発現するHeLa細胞を樹立し, FLAG抗体よるタンパク質の濃縮, 質量分析計LC-MS/MS解析によってPITX1に直接結合している分子を同定する実験系を構築した. 実験の結果, Flag-PITX1と結合する因子としてRNA helicase Aを同定した. RNA helicase Aはテロメレース抑制遺伝子としてこれまで報告のあるp53やCTCF, HDAC1などの分子と結合する因子であり, PITX1-RNA helicase A複合体を介した新たなテロメレース制御機構の分子ネットワークの存在が示唆された. さらに, RNA helicase Aのテロメレース制御への関与を直接的に解析するために, siRNAを用いた発現抑制実験を行った. 細胞には, RNA helicase Aを発現するHeLaおよびSiHa細胞を用い, siRNAをり導入後48hrおよび72hr後の細胞において, qRT-PCRによってhTERTの発現量の定量化を行った. その結果, 72hr後ではHeLaではおよそ2倍, SiHaでは3.75倍のhTERTの発現上昇が認められた. これらの結果より, PITX1はRNA helicase Aと機能的な複合体を形成して, テロメレースの発現を負に制御している可能性が示唆された.
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