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2012 年度 実績報告書

細胞内ポリアミンの蛍光モニタリングシステムによるがん細胞の可視化

研究課題

研究課題/領域番号 22501019
研究機関東京慈恵会医科大学

研究代表者

松藤 千弥  東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50192753)

研究分担者 村井 法之  東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60300927)
研究期間 (年度) 2010-04-01 – 2013-03-31
キーワードがん細胞の特性 / ポリアミン / 翻訳調節 / 蛍光タンパク質 / アンチザイム
研究概要

昨年度はアンチザイム1の全ての塩基配列と緑色蛍光タンパク質EGFPのみを使用したコンストラクトを作製した。具体的には、アンチザイム1をN末端にからフレームシフト部位までの配列(シュードノット構造有無の2タイプを作製)とそれ以降に分けてEGFPの配列を挟むように連結した。さらに、抗HA抗体や抗FLAG抗体を用いたイムノブロッティングによるフレームシフトプロダクトの検出が可能なようにHAとFLAGの両タグをN末端に付加した。これらのコンストラクトは細胞内でポリアミンが高値となったとき、EGFPを含むフレームシフトプロダクトが合成され、蛍光顕微鏡により観察された。また、細胞内のフレームシフトプロダクトの発現を抗HA抗体によるイムノブロットによる解析からもポリアミンによる明らかな発現上昇がみられた。
現状において、常に発現しているHAタグが付加したAZ1のORF1領域の発現量と、ポリアミン濃度が高くなったときに発現するHAタグ、FLAGタグ、AZ1およびEGFPの融合タンパク質の蛍光強度の測定により、ある程度のポリアミンの高低を検出することは可能である。しかし当初の計画のように、2つの蛍光タンパク質を用い、蛍光の種類と強度差により細胞内のポリアミン濃度を可視化しおおよそ定量する系を確立するには至っていないため、今年度は2つの蛍光タンパク質(ECFPとKeima-Red)を使用しコンストラクトの改良を試みた。しかし、ポリアミン添加によるフレームシフトがほとんど起こらないため蛍光強度の差が観察されなかった。フレームシフト部位の前に蛍光タンパク質を導入するとフレームシフトがほとんど起こらなくなることが明らかとなった。今後EGFP単一のコンストラクトで計画を進めるか検討中である。
上記の理由により、今年度のトランスジェニックマウスの作成には至らなかった。

現在までの達成度 (区分)
理由

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (1件)

すべて 2013

すべて 学会発表 (1件) (うち招待講演 1件)

  • [学会発表] 動物細胞におけるポリアミン恒常性の維持機構-アンチザイムを中心に-2013

    • 著者名/発表者名
      村井法之
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      仙台
    • 年月日
      20130327-20130327
    • 招待講演

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公開日: 2014-07-24  

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