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今年度は、分析試料の多次元分画による絶対定量解析の感度と網羅性の向上に取り組んだ。具体的にはタンパク質レベルおよびペプチドレベルでの分画手法の導入による分析可能タンパク質数の向上を図った。出芽酵母から抽出した総タンパク質を電気泳動で分離後、24個のゲル断片に切り分けゲル内でペプチドに消化し、それぞれをLC-MS/MSにより分析した。また一方で、総タンパク質をペプチドに断片化後、液相の等電点電気泳動により24個の画分に分離し、LC-MS/MS分析に供した。
多次元分画の導入により検出されたタンパク質数が約700種類から約3000種類へと増加し、約4倍の解析能力の向上が可能となった。また、解析に用いるタンパク質の量を検討したところ、250μgと750μgとで検出タンパク質数に大差なかったことから、1mg以下のタンパク質で十分であることが分かった。さらに、2種類以上のペプチドが検出されたタンパク質の割合が多次元分画の導入により50%から75%へと向上し、より信頼性の高い解析結果を得ることができた。本タンパク質数(3000種類)はプロテオームの約半数に相当する。
また、解糖系、発酵、TCAサイクル、酸化的リン酸化などの代謝経路に関わる約90種類の酵素について、その約90%が検出可能となった。さらに、各タンパク質で検出されるペプチド数も平均して約4倍に増加し、より定量に適したペプチドの選別が可能となった。
以上より、代謝関連酵素群の定量解析に必要な感度を有する分析システムを構築することができた。
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