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本研究の目的は、1コピーで安定に維持されるHACベクターを利用して、ゲノム配列機能を検定する方法の開発と確立である。今年度はヒト主要組織適合抗原遺伝子クラスターの一つであるHLA-G遺伝子上流域に見いだされた、発現抑制に関与する候補配列の機能検証を行った。
1、HLA-Gの最小プロモーターおよびCMVプロモーターとEGFP遺伝子からなる発現カセットに、遺伝子抑制の候補配列を連結した検証用コンストラクトを作製した後に、HACベクターを保有するヒトHT1080細胞に導入し、HACベクターに1分子の検証用コンストラクトを搭載した細胞株を10株作製した。
2、各細胞株のEGFP蛍光観察とRT-PCRによる発現解析より、検証配列にはHLA-G遺伝子プロモーターに対する発現抑制効果があり、加えてCMVプロモーターに対する抑制効果があることを実証した。本配列による遺伝子抑制は、特定プロモーターに対する効果ではなく、一般的効果であることが推測された。
3、発現抑制効果の一般性を検証するためにマウス細胞を用いて検討し、HT1080細胞と同様な発現抑制効果を確認した。
4、発現抑制に関与する配列は、トランスポゾンであるLINE1の一部に対応した。遺伝子発現の抑制機能に関して、一般的なLINE1配列と検証配列とを比較検討した。その結果、HLA-Gの上流に見いだされた特定のLINE配列が発現抑制効果を有することがわかった。
5、抑制効果の機構を明らかにするために、特定LINE配列のDNA2次構造に注目して検討を進めた。
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