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2010 年度 実績報告書

架橋反応の頻度で測るクロマチン構造と幹細胞研究への応用

研究課題

研究課題/領域番号 22510219
研究機関藤田保健衛生大学

研究代表者

石原 悟  藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (00300723)

キーワードクロマチン / ヌクレオソーム / SEVENS法 / ホルマリン
研究概要

本研究代表者が開発したSEVENS法は、クロマチン内のヌクレオソームの局所的密度を、ホルマリンの架橋頻度で推定するものです。この方法をマウスT細胞に応用した場合、ホルマリン濃度は0.75%で良好な結果が得られていました。今回、ヒト培養細胞に対しSEVENS法を用いるにあたり、その反応条件の検討を行いました。ヒト胎盤絨毛由来のJEG3細胞はマウスT細胞に比べてサイズが大きく、細胞あたりの蛋白質量は多いと考えられました。そこで、T細胞と同様の架橋条件がヒト培養細胞で再現されるにはより高濃度のホルマリンが必要とされると考え、0.8、0.9%と濃度をふってSEVENS法を試行しました。その結果、クロマチン構造がオープンな領域は期待されたとおり上部画分に濃縮されたものの、クローズな領域は下部画分にみられませんでした。これらの領域の分布を詳細に解析したところ、その多くが不溶性画分として遠心チューブの底に沈殿することが分かりました。つまり、高濃度ホルマリンによる架橋反応は、一部のクロマチン(特にクローズされた領域)を選択的に不溶化させるため、その処理によるサンプルの生化学解析を困難にすることが分かりました。そもそも、広く用いられているクロマチン免疫沈降(ChIP)法は通常1%で行われている場合が多く、可溶化されている画分のみ用いられるため、不溶性画分には着目されてきませんでした。しかし、今回得られた知見によると、ホルマリン架橋反応後に抽出されるクロマチンにはバイアスが掛かっており、比較対象の遺伝子間での免疫沈降の条件が必ずしも同じでないことを示しています。したがって、可溶化反応を含めたより詳細な条件検討が、SEVENS法のみならず、ChIP法の改良につながると考えられます。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2010

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] A new fractionation assay, based on the size of formaldehyde-crosslinked, mildly sheared chromatin, delineates the chromatin structure at promoter regions.2010

    • 著者名/発表者名
      Satoru Ishihara
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Research

      巻: 38 ページ: e124

    • 査読あり
  • [学会発表] Sequential rearrangement and eviction of nucleosomes allow interleukin-2 transcription following T cell activation.2010

    • 著者名/発表者名
      石原悟
    • 学会等名
      The NIBB Conference "DYNAMIC GENOME"
    • 発表場所
      自然科学研究機構岡崎コンファレンスセンター(愛知県岡崎市)
    • 年月日
      2010-10-16

URL: 

公開日: 2012-07-19  

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