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2012 年度 実績報告書

高純度ウイルス粒子の試験管内合成とナノテクノロジーへの応用

研究課題

研究課題/領域番号 22560774
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

今高 寛晃  兵庫県立大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50201942)

研究期間 (年度) 2010-04-01 – 2013-03-31
キーワードタンパク質合成 / ウイルス / セルフリーシステム / 脳心筋炎ウイルス / 試験管内合成 / ドラッグデリバリー / E型肝炎ウイルス / バイオイメージング
研究概要

最終年度である24年度はウイルス殻の加工に力を注いだ。脳心筋ウイルス(EMCV)のカプシドタンパク1Dにあるループ1は粒子の外側に突き出ていることがわかっているため、その部位にFLAG配列を挿入した。カプシドL-1D(FLAG)をヒト細胞抽出液由来試験管内タンパク質合成系で発現させ、粒子を形成させた。そしてFLAGカラムで精製し、透過型電子顕微鏡で形態を観察したところ直径10nm程度の非常に小さな粒子が形成されていた。野生型のEMCVは直径30nmであるため、正常な形をとっているとは言い難かった。そこで野生型のL-1DとL-1D(FLAG)を7:3の割合で発現させ、ところどころにFLAGが突き出るように工夫した。そうすると大きさも30nm程度の粒子ができた。そこでFLAG配列の近傍にRGD配列を挿入した。RGD配列は腫瘍細胞で多く発現しているインテグリンに結合するため、腫瘍細胞をターゲテイングすることができる。現在粒子を形成させているところである。
一方、E型肝炎ウイルスのカプシドタンパクORF2を利用するためにORF2を大腸菌で発現させ、カルシウム存在下でインキュベートすると粒子が形成された。この粒子は透過型電子顕微鏡観察で直径30nmの典型的なE型肝炎ウイルス様形状を呈していることがわかった。ORF2のN末はカプセルの内側、C末はカプセルの外側に向いている事がわかっている。そこでC末にRGD配列を入れて粒子を形成させた。そして、できあがった粒子をメラノーマ細胞とインキュベートすると効率良く細胞に取り込まれることがわかった。カプセルの内側に量子ドットを挿入するため、市販の量子ドットを粒子形成の際に共存させた。すると量子ドットを内包する粒子が2-3割の確率で形成された。これはN末に存在しているヒスタグと重金属との相互作用に拠るものと考えられた。

現在までの達成度 (区分)
理由

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Purification and visualization of encephalomyocarditisvirus synthesized by an in vitro protein expression system derived from mammalian cell extract2013

    • 著者名/発表者名
      Tominari Kobayashi, Jun Yukigai, Kosaku Ueda, Kodai Machida, Mamiko Masutani, Yuri Nishino, Atsuo Miyazawa and Hiroaki Imataka
    • 雑誌名

      Biotechnology Letters

      巻: 35 ページ: 309-314

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Reconstitution of eukaryotic translation initiation factor 3 by co-expression of the subunits in a human cell-derived in vitro protein synthesis system2013

    • 著者名/発表者名
      Mamiko Masutani
    • 雑誌名

      Protein Expression and Purification

      巻: 87 ページ: 5-10

    • DOI

      10.1016/j.pep.2012.10.001

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Synthesis of encephalomyocarditis virus in a cell-free system: from DNA to RNA virus in one tube2012

    • 著者名/発表者名
      Tominari Kobayashi, Yusuke Nakamura, Satoshi Mikami, Mamiko Masutani, Kodai Machida, Hiroaki Imataka
    • 雑誌名

      Biotechnology Letters

      巻: 34 ページ: 67-73

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Reconstitution of the human chaperonin CCT by co-expression of the eight distinct subunits in mammalian cells2012

    • 著者名/発表者名
      Kodai Machida
    • 雑誌名

      Protein Expression and Purification

      巻: 82 ページ: 61-69

    • DOI

      10.1016/j.pep.2011.11.010

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Single molecule imaging with a tagged ribosome to explore trans-translation2012

    • 著者名/発表者名
      Hiroaki Imataka
    • 雑誌名

      J Biochemistry

      巻: 152 ページ: 293-295

    • DOI

      10.1093/jb/mvs091

    • 査読あり
  • [学会発表] Cell-free RNA replication systems based on a human cell extracts-derived in vitro translation system with the encephalomyocarditisvirus RNA2012

    • 著者名/発表者名
      Tominari Kobayashi
    • 学会等名
      第85回日本生化学会
    • 発表場所
      マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 改変カプシドを持つ脳心筋炎ウイルス粒子の合成2012

    • 著者名/発表者名
      行貝純
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会
    • 発表場所
      マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] E型肝炎ウイルス様粒子の試験管内再構成2012

    • 著者名/発表者名
      上田友作
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会
    • 発表場所
      マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] ヒトin vitroタンパク質合成系を利用したヒトリコンビナントCCTの機能解析2012

    • 著者名/発表者名
      町田幸大
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー「分子シャペロンの機能発現の新展開と細胞制御」
    • 発表場所
      大阪大学蛋白質研究所
    • 年月日
      20121115-20121116
    • 招待講演
  • [学会発表] ヒ ト因子由来再構成型翻訳システムを利用したヒトリコンビナントCCTサ ブユニットの解析2012

    • 著者名/発表者名
      町田幸大
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場
    • 年月日
      20120620-20120622
    • 招待講演
  • [図書] Cell-free protein synthesis2012

    • 著者名/発表者名
      Kodai Machida
    • 総ページ数
      11
    • 出版者
      Intech

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公開日: 2014-07-24  

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