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CENP-T/CENP-W複合体が結合するCENP-A近傍のクロマチン構造の実体解明を目指して、CENP-T/CENP-W複合体をベイトとして、ニワトリDT40細胞からクロマチン免疫沈降実験を行ない、複数の成分(CENP-T/CENP-W chromatin associated proteins:以下TW-chropと呼ぶ)を見出している。
本年度は、これらTW-chropのセントロメア機能における機能解析について以下の3点を中心に実施した。
1、各TW-chropのニワトリDT40細胞内における局在解析
各TW-chropとGFPタンパク質を融合し、ニワトリDT40細胞に導入して細胞内局在を網羅的に観察した。その結果、TW-chropの一つであるEaf6タンパク質(CENP-28)がセントロメアに局在することを明らかにした。
2、Eaf6タンパク質複合体の精製および同定
FLAGタグ融合型Eaf6を発現するDT40細胞株を樹立した。その細胞株の全細胞抽出液からFLAGタグ特異抗体ビーズを用いた共免疫沈降によりEaf6タンパク質複合体を精製し、高感度質量分析に供した。その結果、ヒストンアセチル化酵素を含むEaf6タンパク質複合体因子の同定に成功した。
3、TW-chropの遺伝子破壊DT40細胞株の作製
TW-chropの細胞における機能解析を目指し、ニワトリDT40細胞において各々の遺伝子破壊株の作製に着手した。Eaf6遺伝子破壊株の作製は既に終了し、今後詳細な機能解析を行う計画である。
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