| 研究課題/領域番号 |
22570049
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
定塚 恵世 静岡県立大学, 大学院・薬学研究科, 博士研究員 (60517887)
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| 研究分担者 |
野口 博司 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (60126141)
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| キーワード | 遺伝子ターゲティング / 相同組換え / 変異導入 / 植物 / イネ / 形質転換 / バイオテクノロジー / 遺伝子 |
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| 研究概要 |
ゲノム配列を自在に改変できる遺伝子ターゲティングは、ゲノム配列が明らかとなった生物で早急に求められている手法であるにも関わらず、高等植物では特に遅れており、相同組換えを用いたゲノム改変法の確立と普及が急務である。申請者らは、世界に先駆けて穀物のモデル植物であるイネのゲノムを改変し、思い通りの変異体を作出してきたが、ターゲティング頻度が低いため、大規模な実験と材料が必要であった。そこで本研究課題では、高等植物のターゲティングの汎用化を目指し、ターゲティング時の正確な組換え機構を理解し、適切な組換え酵素(λRed系)を一過的に発現させてターゲティング頻度を飛躍的に増加させることを目的とする。さらに、ターゲティング頻度を簡便に測定するためのアッセイ用ベクターも構築し、ターゲティング頻度をさらに向上させることが可能な最適ベクターの構築も試みる。
今年度は、予定通りλRed系酵素を発現させるためのプラスミドの構築に着手し、ほぼ完成した。それゆえ、λRed系酵素群を必要なときのみ発現させるための、誘導性プロモーターの導入も検討している。アッセイ用ベクターには特定の点変異が導入されると除草剤耐性となるALS遺伝子を用いることとし、イネALS遺伝子が座上するBACプラスミッドを入手した。さらに、除草剤耐性を賦与するために、特定の点変異をBAC上のALS遺伝子に導入することにも成功した。さらに、作成した変異型ALS遺伝子を用いて、ポジティブ・ネガティブ選抜が可能で、アグロバクテリウア菌による植物への形質転換も可能な、バイナリーベクターを構築しつつある。また、イネカルスへの形質転換実験をくり返し、複数のアグロバクテリウア菌や、バイナリーベクターの組み合わせで最適化を図り、それぞれで形質転換頻度が最大となる培養条件の検討も行った。実験はほぼ計画どおりに進んでいる。
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