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2011 年度 実績報告書

膜蛋白質の結晶化を促進する人工蛋白質リガンドの構築法に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号 22570114
研究機関京都大学

研究代表者

野村 紀通  京都大学, 医学研究科, 助教 (10314246)

キーワード膜輸送体 / X線結晶構造解析 / 結晶化リガンド / 抗体フラグメント / ファージディスプレイ
研究概要

結晶構造解析の対象として、ラット由来フルクトーストランスポーターGLUT5を選定した。哺乳類細胞において細胞膜を介した糖の受動輸送は、促進拡散ヘキソース輸送体(GLUTs glucose transporters)による受動輸送により行われる。GLUTsには14種類のアイソフォーム(GLUT1~14)が存在するが、それらのX線結晶構造解析は皆無である。GLUTsの構造を決定し、糖輸送の分子機構や基質認識特性の構造的基盤を明らかにすることにより、細胞内のヘキソース濃度の調節、ひいては糖尿病や生活習慣病の予防・改善に資する新たな知見が得られると期待できる。
昨年度の当研究課題において、ラット由来GLUT5トランスポーターに対してFv抗体フラグメントを作製し,GLUT5/Fv複合体結晶が得られている。また,この複合体結晶について結晶化条件の最適化を行い,X線回折実験を実施した結果,最高で3.7A分解能程度まで反射を示すデータが得られている。本年度は、(1)さらに分解能を改善すること,(2)位相決定のために重原子置換体の回折データ収集を行うこと、の二点を目指した。
各種の添加剤等により結晶中の蛋白質間の相互作用を安定化し結晶の質をさらに向上させた。また、Fv抗体フラグメントの分子表面のうち結晶パッキングに関与すると予想される部位に存在するLys、Glu、Gln等の側鎖の大きいアミノ酸残基をAla、Thr,、Tyr等に置換することにより、分子表面のエントロピーを低下させ結晶パッキングの改善を図った。このような結晶最適化のプロセスには多数の添加剤/Fv変異体を組み合わせて作製した結晶サンプルをSPring-8放射光施設で回折実験に供した結果、最高で3.2Aの分解能の回折データを得た。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

開発した技術の実証試験として哺乳類SLC輸送体について構造解析可能な良質結晶を得ることに成功しており、新規構造の決定にあと一歩というところに到達できている。この結果は、本研究で作製した抗体フラグメントが結晶化リガンドとして良好に機能しうることを強く示唆しているので、当初の研究計画に沿って順調に進展しているといえる。

今後の研究の推進方策

現状の分解能の回折データセットを解析に用いた場合,Fv部分の構造モデルの分子置換だけでは位相を決定することができないので重原子置換体結晶の回折データを収集することが今後必要となる。すでにGLUT5/Fv複合体をHgやPb化合物で修飾することによって得た同型置換体結晶があるので、XAFSを行い、異常分散が認められた波長でデータセットを収集する予定である。研究計画の変更等はない。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2012 2011

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] protein-coupled receptor inactivation by an allosteric inverse-agonist antibo2012

    • 著者名/発表者名
      Hino T., et al
    • 雑誌名

      Nature

      巻: 482 ページ: 237-340

    • DOI

      10.1038/nature10750

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cloning, expression and purification of the anion exchanger 1 homologue from the basidiomvcete2011

    • 著者名/発表者名
      Tokuda N., et al
    • 雑誌名

      Protein Expr.Purif.

      巻: 79 ページ: 81-87

    • DOI

      10.1016/j.pep.2011.04.006

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Evaluation of the Pichia pastoris expression system for the production of GPCRs for structural analysis2011

    • 著者名/発表者名
      Asada H., et al
    • 雑誌名

      Microbe Cell Fact

      巻: 10 ページ: 24

    • DOI

      10.1186/1475-2859-10-24

    • 査読あり
  • [学会発表] 膜蛋白質のX線結晶構造解析を支援する抗体工学技術の確立2011

    • 著者名/発表者名
      野村紀通, ら
    • 学会等名
      第84回日本生化学会大会シンポジウム「多様な生物種における膜タンパク質の機能理解を目指した新戦略」
    • 発表場所
      京都国際会館
    • 年月日
      2011-09-24
  • [産業財産権] 抗ヒトバンド3モノクローナル抗体2011

    • 発明者名
      小林拓也, ら
    • 権利者名
      科学技術振興機構
    • 産業財産権番号
      特願2011-246364
    • 出願年月日
      2011-11-10

URL: 

公開日: 2013-06-26  

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