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2012 年度 実績報告書

ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iの反応機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 22570122
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

伊藤 恭子(新澤恭子)  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (70206316)

研究期間 (年度) 2010-04-01 – 2013-03-31
キーワード膜タンパク質 / ミトコンドリア呼吸鎖 / 2次元結晶 / ラマン分光法 / フラビン / 鉄硫黄クラスター
研究概要

NADH:ユビキノン酸化還元酵素、(以下複合体I)はミトコンドリア呼吸鎖の最上流部に位置し、NADHからユビキノン(Q10)へと電子を伝達すると共にプロトンを能動輸送する45種類のサブユニットから構成される分子量1000Kの巨大な膜たんぱく質複合体である。このように生理的に重要である一方ミトコンドリア中での主な活性酸素の発生源となっており医学的にも興味が持たれている。本酵素の反応機構を解明するためには立体構造を2次元及び3次元結晶を用いて解明するとともに振動分光学的手法(ラマン、赤外)を用いて活性中心周辺の詳細な立体構造を明らかにすることが必要である。
ウシ心筋ミトコンドリア膜からデオキシコール酸とデシルマルトシドにより可溶化し、ショ糖密度勾配遠心、イオン交換クロマトグラフィーと硫酸アンモニウム分画により精製を行った酵素標品は高い活性と特異的阻害剤ピエリシジンAに対する感受性を保持していたが、ピエリシジンAによる滴定実験の結果、得られた標品中には活性を示さない変性された酵素が含まれることが明らかとなった。そこで、硫安分画の代わりにショ糖密度勾配遠心を行った。すると変性酵素が取り除かれ、2㎛四方以上面積を持つ高い結晶性を示す2次元結晶がえられ、その再現性が格段に高まった。しかし、2次元結晶から電子線回折データを収集するには頻度がまだ不十分であった。2次元結晶を重層させた3次元結晶化を試みたところ偏光顕微鏡下で偏光を示す3次元結晶様の塊は観察されたが単結晶の可能性を示すX線回折は得られなかった。
共鳴ラマン分光法を分子量1000Kの本酵素に適用し、FMN及び鉄硫黄クラスターのラマン線を精度よく酸化型酵素のラマンスペクトルに確認した。更に酸化還元にともなう変化を捉え、この結果とバクテリア由来酵素の構造を比較により本酵素の活性酸素産生を抑える仕組みが示唆された。

現在までの達成度 (区分)
理由

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (18件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (12件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Resonance Raman spectral properties of FMN of bovine heart NADH:ubiquinone2013

    • 著者名/発表者名
      Hikita M
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 52(1) ページ: 98-104

    • DOI

      10.1020/bi3011972

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Reaction mechanism of mammalian mitochondrial cytochrome c oxidase.2012

    • 著者名/発表者名
      Yoshikawa S
    • 雑誌名

      Adv Exp Med Biol

      巻: 748 ページ: 215-236

    • DOI

      10.1007/978-1-4614-3573-0_9

    • 査読あり
  • [雑誌論文] EPR detectionof two protein-associated ubiquinone components (SQ(Nf) and SQ(Ns)) in the membrane in situ and in proteoliposomes of isolated bovine heart complex I.2012

    • 著者名/発表者名
      Ohnishi T
    • 雑誌名

      Biochim Biophys Acta.

      巻: 1817(10) ページ: 1803-1809

    • DOI

      10.1016/j.bbabio.2012.03.032

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Two tyrosyl radicals stabilize high oxidation states in cytochrome Coxidase for efficient energy conservation and proton translocation.2012

    • 著者名/発表者名
      Yu MA
    • 雑誌名

      J Am Chem Soc.

      巻: 134(10) ページ: 4753-4761

    • DOI

      10.1021/ja210535w

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural studies on bovine heart cytochrome c oxidase.2012

    • 著者名/発表者名
      Yoshikawa S
    • 雑誌名

      Biochim Biophys Acta.

      巻: 1817(4) ページ: 579-589

    • DOI

      10.1016/j.bbabio.2011.12.012

    • 査読あり
  • [学会発表] ウシ心筋NADH‐ユビキノン酸化還元酵素の2次元結晶化

    • 著者名/発表者名
      島田悟
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(愛知県)
  • [学会発表] 電子線結晶構造解析によるウシ心筋チトクロム酸化酵素・チトクロムC複合体の立体構造解明

    • 著者名/発表者名
      押田幸歩
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(愛知県)
  • [学会発表] 氷晶防止剤の導入方法によるウシ心筋チトクロム酸化酵素結晶の分解能の向上

    • 著者名/発表者名
      畑中美紀
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(愛知県)
  • [学会発表] ウシ心筋チトクロム酸化酵素休止酸化型の高分解能X線結晶構造解析

    • 著者名/発表者名
      矢野直峰
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(愛知県)
  • [学会発表] ウシ心筋チトクロム酸化酵素反応中間体の高分解能X線結晶構造解析

    • 著者名/発表者名
      村本和優
    • 学会等名
      第12回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(愛知県)
  • [学会発表] 水素原子レベルでの酸化還元に伴う構造変化同定を目的としたウシ心筋チトクロム酸化酵素のX線結晶構造解析

    • 著者名/発表者名
      矢野直峰
    • 学会等名
      日本生物物理学会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • [学会発表] An Intermediate Conformation of Cytochrome Oxidase in the Ligand-Free State Identified by Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy

    • 著者名/発表者名
      小倉尚志
    • 学会等名
      日本生物物理学会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • [学会発表] ポンプ・プローブレーザーと同期したパルスフローシステムの開発とそれを用いたタンパク質の時間分解赤外分光解析

    • 著者名/発表者名
      久保稔
    • 学会等名
      日本生物物理学会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • [学会発表] 電子線結晶構造解析によるウシ心筋チトクロム酸化酵素・チトクロムC複合体の立体構造解明

    • 著者名/発表者名
      押田幸歩
    • 学会等名
      日本生体エネルギー研究会 第38回討論会
    • 発表場所
      岡山大学薬学部 大講義室(岡山県)
  • [学会発表] 細菌呼吸鎖cbb3型酸化還元酵素の精製と活性測定

    • 著者名/発表者名
      安藤友里子
    • 学会等名
      日本生体エネルギー研究会 第38回討論会
    • 発表場所
      岡山大学薬学部 大講義室(岡山県)
  • [学会発表] ウシ心筋チトクロム酸化酵素の高分解能X線構造解析と水クラスターの役割

    • 著者名/発表者名
      矢野直峰
    • 学会等名
      日本生体エネルギー研究会 第38回討論会
    • 発表場所
      岡山大学薬学部 大講義室(岡山県)
  • [学会発表] ミトコンドリア呼吸鎖電子伝達系複合体Iに含まれるFMNの共鳴ラマンスペクトル

    • 著者名/発表者名
      引田理英
    • 学会等名
      日本化学会 第93春季年会
    • 発表場所
      立命館大学びわこ・くさつキャンパス(滋賀県)
  • [備考] 兵庫県立大学大学院生命理学研究科ピコバイオロジー研究所タンパク質結晶成長機構研究部門

    • URL

      http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/GCOE/japanese/pico_intro/yoshikawa/index.htm

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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