| 研究課題/領域番号 |
22570124
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
井内 陽子 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (20316087)
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| 研究分担者 |
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
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| キーワード | C-マンノシル化 / 翻訳後修飾 |
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| 研究概要 |
1.研究の目的
タンパク質のC-マンノシル化は、1994年に報告された糖付加修飾で、マンノース1分子がタンパク質トリプトファン残基のインドール環に炭素-炭素結合で付加している。このトリプトファンの修飾はその後、thrombospondintype 1 repeart(TSR)モチーフを含むタンパク質を中心に、分泌タンパク質と膜貫通タンパク質で検出されている。しかし、標的タンパク質の同定以外の情報は少なく、この修飾機構や生理的機能は未同定であるため、本研究では申請者らが作製した抗C-マンノシル化トリプトファン抗体をはじめとするツールを用い、C-マンノシル化の修飾機構と生理的意義の解明に取組む。
2.研究実施内容
C-マンノシル化タンパク質であるトロンボスポンジンのC-マンノシル化を受ける配列(WSPW)を含むTSRモチーフをC-マンノシル化基質として利用するため、このモチーフを細胞表面型、細胞外分泌型、細胞質型として発現するプラスミドを用いて、Western blotting法、ELISA法、FACS法で細胞のC-マンノシル化能を定量する実験系の改良に取り組んだ。さらに、その他にタンパク質のC-マンノシル化と基質タンパク質の細胞内局在の関連を検討する実験系を作製し、これを利用したC-マンノシル化能の測定系を作製に取組んだ。
3.研究結果
これまでに相対的に高感度であったWestern blotting法に加え、個々の細胞についての測定が可能となる抗C-マンノシル化抗体を用いたFACS法の改良に取組んだが、今後の応用にはさらに改良が必要である。一方、C-マンノシル化の抑制する変異導入がひきおこすTSRを含む基質タンパク質系を作製し、基質タンパク質の分泌異常が確認された。この系を応用した細胞のC-マンノシル化能の測定系を現在作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞レベルでのタンパク質のC-マンノシル化の測定には、これまで広く応用されている確立した方法がない。本研究計画ではこれに取組んでいるが、今後の応用のためにはさらなる感度上昇が必要であるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
タンパク質のC-マンノシル化の測定の改善のため、実験に主に利用している作製済みの抗C-マンノシル化トリプトファン抗体の利用に加え、基質タンパク質の局在変化の利用に重点を置く。また、研究の推進のため、新たな抗体作製にも取組む。
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