研究課題/領域番号 |
22570146
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研究機関 | 神奈川工科大学 |
研究代表者 |
小池 あゆみ 神奈川工科大学, 応用バイオ科学部, 教授 (20454176)
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キーワード | シャペロニン / タンパク質 / フォールディング / 相互作用 |
研究概要 |
シャペロニンGroELの反応サイクルは、2つのリングが交互に機能しながらはたらくことが通説として定着してきた。しかし我々は最近、これまでの作用機構モデルでは存在しえないフットボール型反応中間体(2つのリングに同時にGroESが結合した複合体)の重要性を確認したため、シャペロニンの作用モデルを見直す必要がある。本研究では、細胞内光クロスリンク技術を使い、大腸菌の細胞内で形成されたGroELのフットボール型複合体の検出を目指した。光反応性のアミノ酸アナログであるパラベンゾイルフェニルアラニン(pBpa)をGroESのGroEL結合部位に取り込ませ、pBPAとGroELとの間に紫外線照射によって架橋を形成させて細胞内で形成したGroEL複合体の解析を行った。Native PAGEによる分離条件を検討し、ウェスタンブロッティングで解析したところ、細胞内において、1分子のGroELに1分子のGroESが結合した"弾丸型"GroES-GroEL複合体に加え、1分子のGroELに2分子のGroESが結合した"フットボール型"GroES-GroEL-GroES複合体が形成していることが確認できた。 また、蛍光相互相関分光法(FCCS)によって大腸菌内でフットボール型複合体の形成を確認することを目指し、まずは、GFP融合GroESを大腸菌内で発現させて蛍光相関分光法(FCS)を行ったところ、複合体分子量(約800kDa)に相当する分子の蛍光が観察できた。これにより、GroESを別の蛍光ラベルで同時発現させることで、FCCSによるフットボール型複合体の確認が可能であると考えられた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
大腸菌細胞内で形成されたフットボール型複合体を、細胞内光クロスリンク技術で検出することができ、FCCSでも検出できる目処が立った。
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今後の研究の推進方策 |
今後は、各複合体の生成比と培養条件による変化を細胞内光クロスリンク技術で分析する予定である。また、FCCSによるフットボール型複合体の検出も予定通り行う。
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