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我々はヒストン修飾間相互作用による遺伝子転写制御機構を解析する為に、試験管内で遺伝子転写系を再構築し各種実験を行っている。修飾部位に人工的に変異を加えたヒストンやヒストン修飾酵素を組合せ実験を行うことにより、ヒストン修飾の遺伝子転写への影響を解析している。本年度はより高感度かつ定量性の高い試験管内遺伝子転写系の構築を行った。以前は放射性同位体を用いたプライマーエクステンション法を用いていたが、感度・定量性共に十分ではなく改良する必要があった。そこで今年度はRT-PCR法を用いた試験管内遺伝子転写実験系を確立させた。この方法では微量な遺伝子転写サンプルをPCRで増幅できるため検出感度が高く、また定量PCR法を組み合わせることにより、より正確な定量を行うことが可能となる。しかしこの方法では転写の際に用いた細胞抽出液中のRNAも検出してしまう問題点が有る。そこで試験管内転写されたRNAだけを精製するステップを組み合わせた。試験管内遺伝子転写の際にRNAの基質としてBrUTPを取り込ませ、BrUTPに対する抗体で新生されたRNAだけを特異的に精製する方法を用いた。その結果、細胞抽出液中のRNAの影響を大幅に抑制することが可能となった。この実験手技と昨年度までに作製したヒストン修飾部位の変異体で作製したクロマチンを組み合わせることにより、ヒストン修飾の相互作用による遺伝子転写制御の試験管内における解析をより厳密に行うことが可能となった。
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