| 研究概要 |
本課題では、ツマグロヨコバイ唾液に含まれるカルシウム結合タンパク質が師管からの吸汁達成にいかなる機能を果たしているかを明らかにすることを目的に研究を進めた。本年度の結果は以下の通りである。1)主要な唾液成分である80kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列情報をもとに縮重プライマーを設計して取得した部分配列から、RACE法によりcDNA全長配列をクローニングした。予想アミノ酸配列から、カルシウム結合に寄与することが知られるEF-ハンドモチーフを複数有する新規のタンパク質であることが分かった。
2)本タンパク質を組換え大腸菌により発現させることはできたものの、封入体を形成し可溶化することはできなかった。
3)そこで、ツマグロヨコバイ唾液腺を含む頭部抽出物約8000頭分をChelexで処理してカルシウムを除去した後、アセトン沈殿、70%硫安上清を経て、疎水およびゲル濾過クロマトグラフィーにより本タンパク質を精製した。
4)精製タンパク質(♀4頭相当)に5濃度段階で塩化カルシウム溶液を混和して15℃,1時間置いた後、SDS-PAGEで泳動した結果、本タンパク質はカルシウム添加量の増加に伴って、高分子(陰極)側に三段階にシフトすることがわかった。これは、カルシウムイオンが結合したことにより立体構造や荷電の変化が生じたことによると考えられた。また、三段階のシフトは、カルシウム結合部位が複数個あることを示唆している。
5)残りの精製タンパク質については次年度以降の実験に備えるべく、抗体作成に供した。
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