| 研究概要 |
本課題では、Thiobacillus属細菌のチオシアネート加水分解酵素下流遺伝子群の産物を機能的複合体として同定するため、オペロンを構成する4種の遺伝子(orf2,3,4,5)の大量発現系構築を進めている。本年度は以下のように発現条件検討を行った。
(1)膜外ドメイン遺伝子産物:ABC輸送体膜外ドメインに相当するorf2およびorf3について、大腸菌や出芽酵母を宿主として可溶性発現を試みた。大腸菌では各遺伝子発現系を別個に構築した場合と一つのポリシストロニック発現系として導入した場合においてスクリーニングを行った。いずれの場合でも遺伝子産物は封入体発現し、これにグアニジンまたはグアニジン・アルギニン巻戻し系を適用することで可溶性画分内に獲得できることを確認した。また低温誘導プロモータ制御下に置くことにより両産物の発現量が飛躍的に増加することを見出した。出芽酵母-2μ系ベクターの組換え系においてはGAL1プロモータ下流に配列を挿入して誘導発現を行ったものの、可溶化性状は大腸菌宿主と同程度であった。さらにorf4遺伝子を同時に組み込み共発現を試みたが、発現プロファイルに大きな変動は生じなかった。
(2)膜内ドメイン遺伝子産物:膜貫通配列を有するorf4およびorf5については、C末にGFPを融合した形状でコンストラクトを構築し、膜画分での発現探索を継続して行った。大腸菌および出芽酵母宿主においてオペロン全長または両遺伝子を別途発現させた場合、さらに各遺伝子の末端配列トランケーションを試みたところ、それぞれ大腸菌で全長発現させた場合で収量が最も高く、GFP蛍光強度から見積もられる菌体内発現量は、orf4で100ug/L,orf5で20ug/Lであった。可溶化および精製を行うに際しては発現量向上が必要であると判断された。
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