| 研究概要 |
本研究では，加水分解酵素（アノマー保持・反転型の両者）改変酵素を作出しオリゴ糖の効率的生産への応用利用を示す．
１．アノマー保持型酵素：ミツバチαグルコシダーゼの機能（下記３点）に強く関与するホットスポットを改変した．すなわちわずか２アミノ酸残基の変異により，(1)基質特異性（ショ糖・マルトオリゴ糖），(2)糖転移率，(3)転移生成物の結合特異性（α1,4およびα1,6)が著しく変化した．マルトースからパノース，ショ糖からエルロースやテアンデロースを効率良く生成する変異酵素が作出された．変異酵素による触媒速度は，転移反応のために通常のミカエリス・メンテン式から逸脱し，高基質濃度により活性化または活性抑制の場合があり，これらは加水分解-転移反応モデルにより解釈された．
２．アノマー反転型：(1) アノマー反転型加水分解酵素(GA酵素，トレハラーゼ)に一次構造上類似する転移酵素(DD酵素)を解析した．1. 求核触媒残基をAla, Serに置換した酵素は，通常の基質に対する活性を失うが，通常の基質ではないβフッ化糖を基質として転移する，グライコシンターゼ活性を示した．酸塩基触媒残基変異酵素は，通常の基質に対する活性を失うが，良い脱離基を持つαフッ化糖には作用した．以上により，DD酵素の触媒残基を生化学的に決定した．2. GA酵素の触媒中心近傍の16アミノ酸残基のうち，DD酵素では保存されない７アミノ酸残基を解析した．求核触媒残基周辺の3残基のGA酵素型への変換によりDD活性は失われ，この領域がDD活性に必須であることが示された．(2) アノマー反転型トレハラーゼのグライコシンターゼ化に成功した．作出したサブサイト-1変異酵素は，塩基触媒変異酵素よりも高効率でβフッ化グルコースからトレハロース合成を触媒した．サブサイト＋１変異を導入し， ガラクトース，タロース等を含む２糖が合成された．
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