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(プロ)レニン受容体(PRR)は昇圧酵素レニンならびにその前駆体プロレニンをリガンドとする1回膜貫通型受容体である。PRRの細胞内分布ならびにその局在機構については不明な点が多い。申請者はこれまでに、PRRの細胞外領域に結合し、PRRを小胞体に局在させる膜タンパク質が存在している可能性を示唆するデータを得ており、本研究でその実証を目指している。
本年度、当初計画に沿って、GSTタグを付加したヒトPRRを発現するヒト肝臓細胞(樹立済み)から、アフィニティー担体を用いてPRR結合タンパク質の精製を進めていたが、その過程で、当該細胞が目的タンパク質を発現しなくなった。導入遺伝子が脱落していないことが確認されたたことから発現誘導を試みたものの、発現量は期待するレベルまでは回復しなかった。
そこで研究計画を変更し、エピソーマル型発現ベクターを用いて、FLAGタグを付加したヒトPRRを安定発現するヒト腎臓細胞を新たに樹立した。これと並行して、ネガティブコントロールとして、PRRを組み込んでいないベクターを導入した細胞株を樹立した。抗FLAG抗体ならびに抗PRR抗体を用いたウェスタンブロット解析ならびに間接蛍光抗体法を用いた細胞内局在の観察から、目的とする細胞株が樹立できたことを確認した。両細胞から細胞溶解液を調製し、アフィニティー担体を用いてPRR結合タンパク質を精製した。その結果、SDS-PAGE後の銀染色で、PRRを発現する細胞に特徴的に検出されるタンパク質バンドが見出された。現在、このタンパク質の単離を進めている。
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