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2012 年度 実績報告書

リン酸親和性水晶発振子マイクロバランス法を用いたリン酸化生体分子の解析

研究課題

研究課題/領域番号 22590037
研究機関広島大学

研究代表者

木下 英司  広島大学, 医歯薬保健学研究院, 准教授 (80304418)

研究期間 (年度) 2010-04-01 – 2013-03-31
キーワードリン酸化 / 水晶発振子マイクロバランス / QCM / バイオセンサー / フォスタグ / 分子認識 / 蛋白質 / 分析化学
研究概要

申請者が開発した2価のリン酸アニオンを特異的に捕捉するフォスタグを水晶発振子マイクロバランス(QCM)法に適用させることが本研究の目的である。水晶発振子とは,水晶の結晶を極薄い板状に切り出した切片の両側に金属薄膜を取り付けた構造をしたもので,それぞれの金属薄膜に交流電場を印加するとある一定の周波数で振動する性質を示す。この水晶発振子の表面に物質が付着すると物質の質量に比例して振動数が減少するため微量天秤として利用することができる。そこで当該年度では,フォスタグをQCM法におけるホスト分子として適用させ,様々なゲストサンプル(リン酸化生体分子)を測定するためのアプリケーションの創出を試みた。以下に研究の成果を列記する。1)ビオチン化フォスタグ誘導体であるBTL-111(ビオチンとフォスタグ分子間に12分子のエチレングルコールを導入した誘導体)を固定化した QCM センサーチップを作成した。2)リン酸化タンパク質であるβカゼインを結合させ,アルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化アッセイ法の開発を試みた結果,リアルタイムな脱リン酸化反応を追跡することが可能となった。3)5'末端にリン酸基が付加されたDNAおよび付加されていないDNAを用いた結合実験を試みた結果,リン酸基が付加されたDNAのみが検出された。4)アレル特異的PCR法と組み合わせることで,ホモ変異の検出が可能となった。このことから,ホモ変異の遺伝子診断が可能であることがわかった。以上より,ビオチン化フォスタグ誘導体BTL-111を固定化させたQCM センサーチップを用いることで,より幅広いリン酸化生体分子の解析に応用できるものと期待している。

現在までの達成度 (区分)
理由

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (17件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 1件) 図書 (3件)

  • [雑誌論文] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag2013

    • 著者名/発表者名
      Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T
    • 雑誌名

      Anal. Biochem

    • DOI

      DOI:10.1016/j.ab.2013.03.029

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules2013

    • 著者名/発表者名
      Tsunehiro, M.
    • 雑誌名

      J. Chromatogr. B

      巻: 925 ページ: 86-94

    • DOI

      10.1016/j.jchromb.2013.02.039.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A laborsaving, timesaving, and more reliable strategy for separation of low-molecular-mass phosphoproteins in Phos-tag affinity electrophoresis2012

    • 著者名/発表者名
      Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T
    • 雑誌名

      Int. J. Chem

      巻: 4 ページ: 1-8

    • DOI

      DOI:10.5539/ijc.v4n5p1

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Highly sensitive detection of protein phosphorylation by using improved Phos-tag Biotin2012

    • 著者名/発表者名
      Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., Sugiyama, Y., Fukada, Y., Ozeki, T., and Koike, T
    • 雑誌名

      Proteomics

      巻: 12 ページ: 932-937

    • DOI

      DOI:10.1002/pmic.201100639

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Protein phosphorylation in encystment-induced Colpoda cucullus: localization and identification of phosphoproteins2012

    • 著者名/発表者名
      Sogame, Y.
    • 雑誌名

      FEMS Microbiol. Lett.

      巻: 331 ページ: 128-135

    • DOI

      10.1111/j.1574-6968.2012.02560.x.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] EF-1α and mitochondrial ATP synthase β chain: alteration of their expression in encystment-induced Colpoda cucullus2012

    • 著者名/発表者名
      Sogame, Y.
    • 雑誌名

      J. Eukaryot. Microbiol.

      巻: 59 ページ: 401-406

    • DOI

      10.1111/j.1550-7408.2012.00628.x.

    • 査読あり
  • [学会発表] Phos-tag SDS-PAGE systems for protein phosphorylation profiling under neutral pH conditions2012

    • 著者名/発表者名
      Kinoshita, E.
    • 学会等名
      HUPO 11th Annual World Congress
    • 発表場所
      Hynes Convention Center, Boston, MI, USA
    • 年月日
      20120909-20120913
  • [学会発表] Phos-tagアフィニティ電気泳動の開発と改良~リン酸化タンパク質の分析

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      第62回日本電気泳動学会シンポジウム
    • 発表場所
      慶応義塾大学薬学部,東京
  • [学会発表] 改良型Phos-tag Biotinの開発とリン酸化プロテオミクスへの応用

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      日本プロテオーム学会2012年大会
    • 発表場所
      日本科学未来館,東京
  • [学会発表] リン酸化タンパク質解析のためのフォスタグテクノロジー

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      第63回日本電気泳動学会総会
    • 発表場所
      沖縄コンベンションセンター,宜野湾
  • [学会発表] Phos-tag技術によって新たにできるようになったこと

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      新薬理学セミナー 2012
    • 発表場所
      熊本大学薬学部宮本記念館,熊本市
    • 招待講演
  • [学会発表] SuperSep Phos-tag プレキャストゲル:迅速,高効率,かつ,高精度なリン酸化シグナル伝達分子の分離検出法

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      マリンメッセ福岡,福岡
  • [学会発表] Phos-tag 技術が拓くタンパク質リン酸化研究の新たな潮流

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会シンポジウム
    • 発表場所
      福岡国際会議場,福岡
  • [学会発表] Highly sensitive imaging of protein phosphorylation by Phos-tag technology

    • 著者名/発表者名
      Kinoshita, E.
    • 学会等名
      1st International Symposium on Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling
    • 発表場所
      東大医科研講堂,東京
  • [図書] Phos-tag affinity electrophoresis for protein kinase profiling.2012

    • 著者名/発表者名
      Kinoshita, E.
    • 総ページ数
      22
    • 出版者
      Springer
  • [図書] 臨床プロテオミクス~バイオマーカー探索から個別化医療へ2012

    • 著者名/発表者名
      木下英司
    • 総ページ数
      5
    • 出版者
      金原出版
  • [図書] DNA Replication and Mutation2012

    • 著者名/発表者名
      Kinoshita, E.
    • 総ページ数
      21
    • 出版者
      Nova Science Publishers

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公開日: 2014-07-24  

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