研究課題
Tol2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系の検討を昨年度に引き続き進めた。ニワトリのBACライブラリーより単離したコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)のプロモータがT2トランスポゾン発現ベクターと組み合わせるとあまり有効に機能していないことが前年度の研究で明らかになった。そこで脊髄運動ニューロンに優位に発現するLimホメオ蛋白の一つであるislet-1遺伝子のエンハンサー領域を用いてT2トランスポゾン発現ベクターを作成し、その遺伝子導入について検討した。ChATプロモータを有する発現ベクターと同様に遺伝子導入操作を行ったところ、遺伝子導入直後(E5～E6)は前角の運動ニュー白ンにGFPが発現するのが確認されたが、さらに後期胚(E8～E10)では前角以外の脊髄内の細胞に広範にGFPの発現が認められた。これは同転写調節領域を単純な発現ベクターを用いて遺伝子導入した場合と異なる結果であった。ChATプロモータで得られた結果と合わせて考えると、T2トランスポゾンに組み込むことで発現強度や特異性などのエンハンサー、プロモータ活性がDNA断片によってまちまちであることが推察された。また運動ニューロン特異的な転写調節領域以外に構成的発現を目的としたEF-1やCMVなどのプロモータと、GFPやDsRedなどの異なる蛍光タンパクの組み合わせでT2トランスポゾン発現ベクターを作成した。これらのベクターを初期の胚に導入したところ、複数の異なる細胞が異なる蛍光タンパクで標識されることを様々な発育ステージで広範な部位で確認することができた。これらの結果をふまえて、1)トランスポゾンに組み込むための新たな転写調節領域の探索、2)既に有効な転写調節領域を用いた様々な機能遺伝子発現ベクターの構築、に関して着手した。
2: おおむね順調に進展している
複数の転写調節領域をT2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系で確認し、後期胚で有効なものを見出すことに成功した。
今後脊髄運動ニューロン、シュワン細胞、骨格筋など当初後期胚で遺伝子導入の標的としていた組織に適した転写調節領域の探索を一層進める予定である。また同様に発生中期～後期で発達する眼球などの組織もトランスポゾンによる遺伝子導入の対象として検討を進めていく。既に効果的な遺伝子導入が認められるアストログリアに関して、機能遺伝子の導入や更なる遺伝子発現調節(発現抑制や薬物による誘導など)の可能性を検討する。
すべて 2011
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (1件)
Front Syst Neurosci
巻: 5巻 ページ: 34
DOI:10.3389/fnsys.2011.00034
Journal of Oral Sci
巻: 53(4) ページ: 523-7
