研究課題
1.Opn蛋白多型による立体構造差異の解析申請者らがすでに明らかにしているMRL系とC3H系マウス間にあるOpnの機能的差異を規定する多型を持つインテグリン結合部位の立体構造差異を明らかにするため、以下の解析を行った。I-1)X線結晶解析による立体構造差異の検索 コムギ胚芽を用いた無細胞蛋白合成システムをつかってOpn多型蛋白を作製し、精製のうえ結晶化し、X線結晶解析を行う。現有機器では全長の解析は困難なため、目的とする部位の近傍約50アミノ酸の蛋白を合成して解析中である。I-2)NMRによる立体構造差異の検索に関しては次年度施行する。II.Opn蛋白機能的結合部位阻害蛋白の設計上記で導き出した立体構造情報をもとに、蛋白構造予測ソフト(総合科学研究支援センターに現有)を用いて、結合阻害蛋白の可能性がある配列を数十個程度候補として抽出した。また、無細胞生命科学工学センターに現有する13,000種類のcDNAライブラリーにある蛋白からも候補を抽出する作業を施行した。現在も施行中である。III.蛍光ビーズを用いた蛋白相互作用解析によるOpn結合阻害蛋白候補のスクリーニングFluorometric Microvolume Assayの原理によるAlpha Screenにより、ビオチン化したOpnと、上記cDNAライブラリーの蛋白を用いて、候補蛋白もビオチン標識して合成し、これらを96穴プレート中で反応させ、結合アフィニティーのあるものをスクリーニングのスクリーニングを施行した。約30種類の蛋白についてスクリーニングし、さらに続行中である。
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