|
真菌症診断の精度・利便性を高める目的で真菌β-D-グルカン（BG)の高特異性・高感度・簡便な測定法の開発を目指した。真菌多糖の血液診断キット（イムノクロマトグラフィー、ELISA）を試作し、真菌感染動物モデル試料中のBG検出を行い、実用性を評価した。３種のBGRPタンパク（Bm、Pi及びTcBGRP）を大腸菌発現系により大量作成し、ビオチン標識体を作製した。BGRPの未標識体とビオチン標識体との組み合わせによりBGを挟むサンドイッチELISAのシステムを応用した検出系を作製した。
真菌Schizophyllum commune由来のSchizophyllanを標準BGとして用い、検出感度の検討を行い、10ng/ml以上のBGを検出できた。
イムノクロマトグラフィー（IC）の試作品として、各種BGRPをメンブランモジュールに固定化した後、BGを作用させ、ビオチン標識BGRP及びStreptavidin-HRPO及びTMBでBG検出する系を構築した。BmBGRP及びPiBGRPは試料中に含まれるSchizophyllanに反応し、BGの存在をスポット状に表すことが出来たが、TcBGRPでは全く陽性反応が認められなかった。TcBGRPはSchizophyllanでなく、無分岐構造の（1→3）-β-D-グルカンには反応することからICでもその特異性が維持されていることが判明した。
真菌感染マウスモデルとして、Schizophyllanを投与したマウスの血漿を経時的に採取し、ELISAで血漿中BGのモニタリングを試みた。尾静脈投与したBGについては2~3分後にピークを示し、24時間後には約90%が血中から消失することが明らかとなった。100ng/mlオーダーの濃度のBGが血中に存在する場合は、本ELISA法によっても十分BGを検出可能であることが示された。
|
