結核菌PE_PGRS タンパク質の病原性に関する機能解析

2012 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 22590411
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 独立行政法人国立国際医療研究センター
• 研究代表者: 切替 照雄 独立行政法人国立国際医療研究センター, 研究所, 部長 (50192563)
• 研究分担者: 舩渡川 圭次 (70536896)
• 研究期間 (年度): 2010 – 2012
• キーワード: PE_PGRS62 / Prdx1 / ペルオキシレドキシン / マクロファージ / 結核

研究概要

PE_PGRS62 は、結核の病原因子の一つであると考えられている。PE_PGRS62 が結核菌の病原因子であるかどうか決定するために、我々が全ゲノムシークエンスした結核菌Erdman 株DNA の情報を元にまずPE_PGRS62/Rv3812 を破壊するための結核菌ファージを作製した。遺伝子破壊株Δ PE_PGRS62 へPE_PGRS62 遺伝子とそのプロモーターを挿入したpMV306(インテグレーションプラスミド、ゲノムに1コピーの遺伝子を挿入する)でPE_PGRS62 遺伝子を相補した株(Δ62Comp)、また、Δ62Comp 株のコントロールとして、目的遺伝子挿入のないpMV306 を導入したΔPE_PGRS62 (Δ62/mock)株も作製した。これらの遺伝子破壊と相補を確かめるために、我々は野生型(WT)、 Δ62/mock、Δ62Comp のそれぞれの菌株からゲノムDNA を抽出した。これらのDNA をSmaI 処理し、得られた断片を特異的なプローブで検出した。次に、WT、Δ62/mock とΔ62Comp のそれぞれの菌株のPE_PGRS62 の発現量を調べた。 これらの菌株を7H9/ADC 培養液中で培養し、RNA を抽出した。PE_PGRS62 の発現量は、特異的なプライマーを用いてqRT-PCR で測定した。その結果Δ62Comp 株のPE_PGRS62 の発現が回復していた。 WT 株、Δ62/mock 株とΔ62Comp 株が7H9/ADC 培養液中で培養した場合、それらの生育速度に違いはなかったが、J774 細胞に感染させた場合は細胞内でのΔ62/mock 株の生存率が減少していた。マウスにおけるΔPE_PGRS62 株の病原性低下を評価するために、WT 株またはΔPE_PGRS62 株をマウスの尾静脈に注射した。ΔPE_PGRS62 株を感染したBALB/c マウスあるいはSCID マウスにおいて、WT 株感染マウスと比較すると顕著な生存日数の遅延が認められた。これらの結果により、PE_PGRS62 が結核菌の病原性に必要であることがわかった。

研究成果

• [雑誌論文] A novel mechanism of growth phase-dependent tolerance to isoniazid in mycobacteria. (2012)
  • 著者名/発表者名: Niki M, Niki M, Tateishi Y, Ozeki Y, Kirikae T, Lewin A, Inoue Y, Matsumoto M, Dahl JL, Ogura H, Kobayashi K, Matsumoto S
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 287(33) ページ: 27743-52
  • DOI: doi:10.1074/jbc.M111.333385.
• [雑誌論文] Complete annotated genome sequence of Mycobacterium tuberculosis Erdman. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi-Akiyama T, Matsumura K, Iwai H, Funatogawa K, Kirikae T.
  • 雑誌名: J Bacteriol. 巻: 194(10) ページ: 2770
  • DOI: doi:10.1128/JB.00353-12.
• [雑誌論文] Comprehensive multicenter evaluation of a new line probe assay kit for identification of Mycobacterium species and detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Mitarai S, Kato S, Ogata H, Aono A, Chikamatsu K, Mizuno K, Toyota E, Sejimo A, Suzuki K, Yoshida S, Saito T, Moriya A, Fujita A, Sato S, Matsumoto T, Ano H, Suetake T, Kondo Y, Kirikae T, Mori T
  • 雑誌名: J Clin Microbiol 巻: 50(3) ページ: 884-90
  • DOI: doi:10.1128/JCM.05638-11.
• [雑誌論文] Genome sequence of clinical isolate Mycobacterium tuberculosis NCGM2209. (2011)
  • 著者名/発表者名: Miyoshi-Akiyama T, Matsumura K, Kobayashi N, Maeda S, Kirikae T.
  • 雑誌名: J Bacteriol 巻: 193(23) ページ: 6792
  • DOI: doi:10.1128/JB.06233-11.
• [雑誌論文] Downregulation of katG expression is associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. (2011)
  • 著者名/発表者名: Ando H, Kitao T, Miyoshi-Akiyama T, Kato S, Mori T, Kirikae T.
  • 雑誌名: Mol Microbiol 巻: 79(6) ページ: 1615-28
  • DOI: doi:10.1111/j.1365-2958.2011.07547.x
• [雑誌論文] Evaluation of a line probe assay for the rapid detection of gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. (2011)
  • 著者名/発表者名: Ando H, Mitarai S, Kondo Y, Suetake T, Kato S, Mori T, Kirikae T
  • 雑誌名: J Med Microbiol 巻: 60(Pt 2) ページ: 184-8
  • DOI: doi:10.1099/jmm.0.024729-0.
• [雑誌論文] Identification of katG mutations associated with high-level isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ando H, Kondo Y, Suetake T, Toyota E, Kato S, Mori T, Kirikae T
  • 雑誌名: Antimicrob Agents Chemother 巻: 54(5) ページ: 1793-9
  • DOI: doi:10.1128/AAC.01691-09.
• [雑誌論文] Pyrazinamide resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Japan. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ando H, Mitarai S, Kondo Y, Suetake T, Sekiguchi JI, Kato S, Mori T, Kirikae T
  • 雑誌名: Clin Microbiol Infect 巻: 16(8) ページ: 1164-8
  • DOI: doi:10.1111/j.1469-0691.2009.03078.x
• [学会発表] マウス感染モデルにおける弱毒型結核菌NCGM2242 の免疫防御反応 (2013)
  • 著者名/発表者名: 加藤雅子,渡邊真弥,松村和典,祝弘樹,舩渡川圭次,切替富美子,秋山徹,切替照雄
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 20130618-20
• [学会発表] A mutation in the decoding region of 16S rRNA attenuates the virulence of Mycobacterium tuberculosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: 渡邊真弥,祝弘樹,舩渡川圭次,配島由二,奥村香世,加藤雅子,橋本雅仁,切替富美子,秋山徹,切替照雄
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 20130618-20
• [学会発表] Mycobacterial PE_PGRS62 is a virulence factor during tuberculosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: 祝弘樹,舩渡川圭次,渡邊真弥,奥村香世,配島由二,加藤雅子,切替富美子,秋山徹,切替照雄
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] イソニアジド耐性に関与する遺伝子変異に関する実験解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 切替照雄、安藤弘樹、加藤正子、秋山徹
  • 学会等名: 第83回実験結核研究会総会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2013-03-27
• [学会発表] 薬剤耐性結核菌迅速検出ラインプローブ法の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 切替照雄
  • 学会等名: 第88回日本結核病学会総会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2013-03-18
• [学会発表] A New line probe assay kit for detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kirikae T
  • 学会等名: The 30^<th> World Congress of Biomedical Laboratory Science
  • 発表場所: Berlin, Germany
  • 年月日: 2012-08-21
• [学会発表] 結核感染に関わる宿主側タンパク質PrxI の機能解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 松村和典、切替照雄
  • 学会等名: 第81回実験結核研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2011-06-01
• [学会発表] Genetic diagnosis of multidrug resistant tuberculosis (2010)
  • 著者名/発表者名: Kirikae T
  • 学会等名: Japan-Russia Workshop 2010 Tokyo, 54^<th> International Science and Technology Center (ISTC) Japan Workshop
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2010-05-30
• [学会発表] Down-regulation of katG expression is associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ando H, Kato S, Mori T, Kirikae T
  • 学会等名: 110^<th> General Meeting of the American Society for Microbiology
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 2010-05-27
• [産業財産権] 結核菌の菌株の同定方法及び遺伝子変異の検出方法 (2013)
  • 発明者名: 秋山徹、切替照雄、奥村香世
  • 権利者名: 秋山徹、切替照雄、奥村香世
  • 産業財産権番号: 特許出願,特願2013-012546
  • 出願年月日: 2013-01-25