| 研究課題/領域番号 |
22590530
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
西田 亙 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (80271089)
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| 研究分担者 |
大澤 春彦 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90294800)
大沼 裕 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 准教授 (00294794)
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| キーワード | レジスチン / モノクローナル抗体 / インスリン抵抗性 |
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| 研究概要 |
ヒトレジスチン全長cDNAを発現ベクターにクローニングし、小麦胚芽を用いて蛋白発現を行った。蛋白合成には、セルフリーサイエンス社の小麦胚芽を用い、医学部コアラボ研究センターの合成装置により自動合成を行った。野生型,GST融合型の2種類で発現を行い、合成・精製条件を種々検討したが、可溶性が低く充分な収量が得られず、また一部蛋白分解も認められた。このため合成方法を当初の計画から変更し、IRESを有したGFPとヒトレジスチンの共発現ベクターをレンチウイルスを用いて、HEK293T細胞へ遺伝子導入した(レジスチンはN末端にシグナルペプチドを有しているため、細胞外に分泌される)。導入細胞株に対して、計4回のFACSを連続して施行し、GFP発現強度の高い細胞集団を得た。培養液DMEM/10%FCS下で拡大培養した後に、無血清培地へ変更し、3日間におよぶ培養後にその上清を回収した。レジスチンは野生型およびC末端ヘキサヒスチジン標識型の2種類を発現させ、それぞれイオン交換クロマトグラフィー・ゲルクロマトグラフィー、His TRAPアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製レジスチンをマウスに免疫し、腸骨リンパ節からリンパ球を回収、細胞融合後にヒスチジン標識型レジスチンをコーティングした96穴プレート上で、クローニングを施行した。複数の陽性クローンを樹立し、現在各クローンの解析を行っている。
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