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2011 年度 実績報告書

Multiplex定量LAMP法によるヘルペスウイルス迅速診断法の確立

研究課題

研究課題/領域番号 22590539
研究機関藤田保健衛生大学

研究代表者

井平 勝  藤田保健衛生大学, 医療科学部, 准教授 (10290165)

研究分担者 杉山 博子  藤田保健衛生大学, 医学研究科, 研究員 (10387714)
榎本 喜彦  藤田保健衛生大学, 医学研究科, 研究員 (00387713)
吉川 哲史  藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80288472)
キーワードVZV / SNP識別 / サイクリングプローブ / Multiplex PCR
研究概要

【目的】LAMP法は迅速、簡易な遺伝子増幅法であるが、定量的評価という点ではreal-time PCR法に及ばない。昨年度は、グアニン消光現象を利用したプローブ(Qprobe)とLAMP法を組み合わせてVZV野生株/ワクチン株の迅速鑑別、定量法の開発を試みた。しかし、同一反応チューブに野生株、ワクチン株のQprobeを混合したMultiplex反応では、probe近傍のグアニンによる消光(交差反応)の影響を解決できなかった。そこで本年度は、DNA-RNAからなるキメラprobeとRNaseの組み合わせによりSNPを含む特定塩基配列を効率よく検出できるサイクリングprobeを用い、real-time PCRと組み合わせてVZVワクチン株、野生株の迅速鑑別、定量方法開発を試みた。【方法と対象】VZVワクチン株と野生株間で遺伝子変異が多く認められるORF62の中に標的領域を設定し、プライマー(野生株、ワクチン株共通)、と野生株、ワクチン株用の型特異的サイクリングprobeを設計した。標的領域をサブクローニングしDNAを抽出後、コピー数を決定、段階希釈して感度決定などの基礎検討に用いた。Real-time PCR反応はStep One(ABI)で行い、それぞれの型特異プローブによるsingleplex反応に加え、両ブローブをミックスしたmultiplex反応でも検討した。【結果】ワクチン株、野生株のsingleplex反応は、10-10^6コビー/反応の間で優れた直線性と相関係数(野生株R^2=0.99 ワクチン株R^2=0.98)を示し、同時再現性でも%CVは5%以下であった。この条件下でワクチン株プローブは10^5コピーの野生株と、野生株プローブは10^5コピーのワクチン株と交差反応を示さなかった。Multiplex反応でも野生株、ワクチン株のsingleplex反応と同等の検出感度であったが、両者の混合サンプルを用いると野生株が10^5コピー/反応以上でワクチン株の検出に影響(Ct値の遅延)があった。臨床検体によるTaqman VZV real-time PCRと野生株サイクリングprobeによる定量結果の相関はr^2=0.85であった。【まとめ】Singleplex/Multiplex PCRの感度は、野生株、ワクチン株それぞれ10コピー/反応、ウイルス量とCt値の間には優れた直線性を確認した。Singleplexサイクリングprobe PCRの日差、同時再現性は優れていた。Multiplex反応では、両ウイルス間の交差反応が示唆された。Singleplex反応による臨床検体の検討では、今回のサイクリングprobe法とLAMP+RFLPによるワクチン株、野生株識別結果は完全に一致していた。また、TaqMan real-time PCRとの比較で、定量性についても良好な結果が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

QprobeとLAMP反応を組み合わせた定量法開発については当初近傍(数塩基はなれたグアニン塩基)の配列によるprobeの消光による影響を過小評価していた。実際の測定では、無視できない影響があり同方法による型判別を断念した。しかしながら、新たに導入したサイクリングprobe法開発が予想より順調に進んだ。

今後の研究の推進方策

本年度は以下の検討を行う
(1)Qprobeの近傍配列を考慮した迅速定量法開発
(2)Multiplex化のための条件設定
(3)LAMP法とサイクリングprobeの組み合わせによる迅速定量法の可能性を検討する

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2012 2011

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Analysis of rotavirus antigenemia in hematopoietic stem cell transplant recipients2012

    • 著者名/発表者名
      Sugata K, Taniguchi K, Yui A, Nakai H, Asano Y, Hashimoto S, Ihira M, et.al
    • 雑誌名

      Transplant Infectious Disease

      巻: 14(1) ページ: 49-56

    • DOI

      10.1111/j.1399-3062.2011.00668.x

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Host factors associated with the kinetics of Epstein-Barr virus DNA load in patients with primary Epstein-Barr virus infection2012

    • 著者名/発表者名
      Nakai H. Kawamura Y, Sugata K, Sugiyama H, Enomoto Y, Asano Y, Ihira M, Ohashi M, Kato T, Yoshikawa T
    • 雑誌名

      Microbiology Immunology

      巻: 56(2) ページ: 93-98

    • DOI

      10.111/j.1348-0421.2011.00410.x

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Different characteristics of human herpesviras 6 encephalitis between primary infection and viral reactivation2011

    • 著者名/発表者名
      Kawamura Y, Sugata K, Ihira M, Mihara T, Mutoh T, Asano Y, Yoshikawa T
    • 雑誌名

      Journal of Clinical Virology

      巻: 51(1)(in process) ページ: 9-12

    • 査読あり
  • [学会発表] Mycobacterium tuberculosis(Mtb) transrenal DNAのLAMP法による検出条件の検討2012

    • 著者名/発表者名
      井平勝、吉川哲史、浅野喜造、鈴木定彦
    • 学会等名
      第4回LAMP研究会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2012-03-03
  • [学会発表] Suitable experimental condition for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in urine by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method2011

    • 著者名/発表者名
      M.Ihira, Y.Asano, Y Suzuki, T.Yoshikawa
    • 学会等名
      2^<nd> Scientific meeting for HIV/AIDS, Influenza and TB Diagnosis by LAMP
    • 発表場所
      Zambia Lusaka
    • 年月日
      2011-10-05
  • [図書] 臨床工学講座生体計測装置学第3版2011

    • 著者名/発表者名
      井平勝
    • 総ページ数
      337
    • 出版者
      医歯薬出版社

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公開日: 2013-06-26  

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