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1) 実施計画に従いTNF-αを標的としてHishot法を行った。Hishot法は前年度までに確立したプロトコールを踏襲し、セレクションはリコンビナントTNF-α固定セファロースを用いたプルダウン法にて行った。2ラウンド後にクローンを分離し、スクリーニングおよび結合性の評価、遺伝子配列の決定を行った。その結果、特異的にTNF-αを認識する抗体フラグメントのクローンを得ることに成功し、Hishot法が任意の標的に対して普遍的に実施し得る方法であることが示唆された。
2) 得られたクローンは前年度に単離した抗インテレクチン抗体フラグメントの抗原認識部位とは異なるアミノ酸配列を持ち、特異的選択性をもったクローンの選別が行われていることが確認された。
3) 本研究で得られた抗インテレクチンおよび抗TNF-αのクローンからHisタグを除去し、N末端側にヒトインテレクチン-1のシグナル配列、C末端側にウサギIgGのFc領域を連結した抗体型クローンを作製し、RK-13細胞にて発現させた。それぞれの抗体型クローンは培養上清に分泌され、特異的ELISAの一次抗体として使用可能であった。TNF-αに対するクローンはH鎖可変領域内のジスルフィド結合が構築されるように設計したクローンで標的に対する反応性が向上した。しかしながら、病理診断や臨床応用可能な強力な結合性を持つクローンは残念ながら得ることが出来なかった。
4) 本年度までのデータを取りまとめ、学術論文として発表した。
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