| 研究概要 |
大腸癌細胞株を用いて、以下の実験を行い大腸癌細胞におけるGST-πのMAP kinase modulatorとしての意義を検討した。
(1)GST-πKOマウス由来正常細胞に対する変異K-ras遺伝子の導入
変異K-RAS遺伝子の発現ベクターを作成し、GST-πノックアウト(KO)マウス由来大腸細胞にリポフェクション法により遺伝子導入し、G418耐性細胞GSTKO/RAS1-3を樹立した。GSTKO/RAS1及びGSTKO/RAS2を培養してMTT assayを行ったところ、いずれもGSTKO/neoに比べ細胞増殖が高まっていた。また、GSTKO/RAS1及びGSTKO/RAS2のTUNEL染色を行ったところ、GSTKO/neoに比べアポトーシスが抑制されていた。
(2)K-ras変異陽性大腸癌細胞へのGST-π siRNAベクターの導入
K-ras変異陽性の大腸癌細胞株M7609にGST-πsiRNAベクターを導入し、stableなGST-πKD細胞(M7609GSTKD)を樹立した。M7609GSTKDの細胞増殖活性をMTT assayにより調べたところ、親株に比べて有意に低下していた。
(3)GST-πKD大腸癌細胞における各種MAPkinaseの発現及び活性
GST-πKD細胞と親株(M7609細胞)にデオキシコール酸(50μM)を添加し、.Western blot法によりP-Raf,p-MEK,P-ERKの発現をそれぞれ調べたところ、GST-πKD細胞ではいずれも有意に発現が低下していた。
以上より、大腸癌細胞においてGST-πはRaf,MEK,ERKなどのMAPkinaseを活性化することにより細胞増殖活性を亢進させていることが明らかとなった。
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