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1. UDCAの作用機序解析
UDCAは細胞膜上のBsepをendocytosis-degradation pathwayから回避させ、細胞膜上のBsepを安定化させることにより、胆汁酸輸送活性を増強していることを平成22、23年に明らかにした。本年度は進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC2）および、良性反復性肝内胆汁うっ滞症（BRIC2）の発症の原因となるBSEP変異体に対するUDCAの影響を検討した。PFIC2変異体としてD482GとG982R、BRIC2変異体としてA570Tを定常的に発現するMDCKII細胞株を樹立し、UDCAを添加、Bsep活性の変化を解析した。その結果、UDCAはBRIC2変異体に対してはwild-typeと同様に活性を約1.3倍に増強したが、PFIC2変異体に対してはほとんど効果がないことが判明した。その原因としてPFIC2変異体蛋白が極端に不安定で、UDCAでrescueすることができないためと考えられた。また、UDCAの効果がBsep特異的であるかを明らかにするため、apical proteinとしてtransferrin receptor、GL-GPIを、basolateral proteinとしてNa+K+-ATPaseに対する影響を検討したが、いずれの蛋白にも影響せず、UDCAの蛋白安定化はBsep特異的であることが判明した。
２．胆汁分泌トランスポーターのクラスター分子の同定
HEK293細胞にBsepのC末端にFlagをタグしたconstructを作成し、定常的に発現する細胞株を樹立した。抗Flag抗体を用いた免疫沈降法によりBsepと結合する４つの新規蛋白を同定した。現在それぞれの蛋白を阻害剤あるいはsiRNAを用いてknockdownし、Bsep蛋白に及ぼす影響を解析中である。
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