| 研究概要 |
心筋転写因子であるTbx5と会合する蛋白を同定するために、野生型(WT)と変異型蛋白(G80R)にFLAGのタグをつけ、HEK293細胞に強制発現し、抗FLAG抗体ビーズを用いて免疫沈降した蛋白をSDS-PAGEで分離した。両者で違いの見られた蛋白について、TOFF-MASSで解析したところ、DNA依存性リン酸化酵素の活性サブユニット(DNA-PKcs)とその制御サブユニットの一つであるKu80であった。そこで、GST-WT、GST-G80Rで[35S]-メチオニンラベルした制御サブユニットKu70、Ku80をプルダウンしたところ、WTでKu70,Ku80が強く会合した。次にGST-Tbx5を基質として、DNA断片で活性化したDNA-PKcsと[32P]-g-GTPを用いて、リン酸化反応をin vitroで確認した。リン酸化部位を同定するために、いくつかの部分に分けてリン酸化を見たが、非特異的反応があり同定不能であった。そのため、DNA-PKcsのリン酸化配列に合致する5力所のセリンスレオニン残基をアラニンに変異させたそれぞれの変異体を作り、リン酸化反応を検討したところ、S289AとS302A変異体のリン酸化が半分程度に低下し、S289A/S302Aの二重変異体は著明に低下し、この2カ所がリン酸化を受けると考えられた。
アフリカツメガエルの心臓よりRNAを抽出し、アフリカツメガエルのTbx5のcDNAのクローニングも終了した。
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