| 研究概要 |
心臓の転写因子であるTbx5の翻訳後修飾を明らかにするため、HEK293に過剰発現したFLAG-Tbx5によるプルダウンアッセイを行い、会合する蛋白としてリン酸化酵素(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit:DNA-PKcs)とその制御蛋白(Ku80)を同定した。Ku80はKu70とともにDNA-PKcsを制御するため、GST-Ku70,GST-Ku80と^<35>S-Tbx5のプルダウンアッセイを行ったところ、Ku80ではなく、Ku70が直接Tbx5に結合する可能性が考えられた。WeStern blotによっても、野生型TbX5とKU70,KU80,DNA-PKcsとTbX5の会合を確認することができた。Ku80は普遍的に発現しているが、マウスのin situ hybridizationでは、すべての組織が染色された。In vitroによる組換えDNA-PKcs蛋白によるリン酸化反応では、GSTと融合したTbx5の欠損変異蛋白は非特異的にリン酸化されてしまい、リン酸化候補部位を絞り込むことができなかった。そこで、DNA-PKのリン酸化コンセンサスシークエンスをTbx5で検索すると5カ所あったので、それぞれの部位をアラニンに置換した変異体を作成した。S289とS301はリン酸化が半分程度になり、S289/S301の二重変異体はほとんどリン酸化されなかった。DNA-PK阻害薬ではTbx5によるANP(600)-luciferaseの活性化は軽度抑制され、Ku70,Ku80,DNA-PKcsのcDNAによる強制発現により、活性化された。さらに、S289,S301変異体は野生型に比較し、ANPの活性化能、Nkx2-5との協調能が低下していた。
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