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本年度は、1.Comparative genomicsを用いた保存領域の探索および2.Zebrafishを用いたin vivoエンハンサーアッセイ系の確立を行った。
HB-EGFの転写開始点から+100～-100kbの配列を対象に種を超えて保存性の高い領域を同定するために、Comparative genomicsを用いてヒト、マウス、ラットなどの哺乳類、さらに鳥類、両生類、魚類のHB-EGF相同配列について解析した。実際には、Pip makerあるいはVISTAを用いたglobal alignmentにより保存領域を視覚化することにより行った。その結果、該当領域は種間での組換えが頻繁に起こり分断されていたが、保存領域を数箇所同定することができた。
上記を補完するアプローチとして、ゼブラフィッシュゲノム配列よりHB-EGF領域をカバーしているBACのin silicoクローニングを行った。続いて、Red/ETというλファージ由来の組み換え酵素を利用し、発現の検出を容易にするためにHB-EGFのcoding領域をGFPに変換したBACを大腸菌内で作成した。同様の方法を用いてゲノム側面にtol2エレメントを挿入した。この段階ではzebrafishでtol2システムがworkするかどうかが不明であったので、まずパイロット研究として心臓特異的遺伝子XのBACシステムコンストラクトを作成し、zebrafishに導入した。その結果、期待されるような心臓特異的発現が得られたため、in vivoエンハンサーを検出することが可能となった。次年度は、本実験としてHB-EGFにおいても進める予定である。
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