| 研究概要 |
本年度も昨年度に引き続き,zebrafishを用いたin vivoエンハンサーアッセイ系の確立などに関する研究を行った。
昨年度報告したように、ゼブラフィッシュゲノムのHB-EGF coding領域内をGFPに変換したBACクローンをTol2システムにより構築した。また、このことに加えてマウスのHB-EGF領域についてもゼブラフィッシュゲノムと同様に、遺伝子周辺を持つBACクローンをスクリーニングし、coding内をGFPに変換したBACクローンを構築した。続いて、それぞれのクローンをトランスポザーゼ2のmRNAとともに、１細胞期の受精卵にマイクロインジェクションした。その後、蛍光顕微鏡下にて心臓の発生が完了する48-72 hpfの期間、観察を行った。その結果、マウスBACにおいては、まったくGFPの発現を得ることができなかった。一方、ゼブラフィッシュBACにおいても、全体的に弱い発現が見えるのみであった。
これと平行して、心不全を惹起する状態を、カテコラミン、あるいは抗癌剤であるドキソルビシンなどで作り出すことを試みた。しかしながら、endogenousのマーカー遺伝子の発現上昇が見られないため、in vivoにおける虚血状態のモデル作成を試みた。実際には、stage topインキュベータ上でガス混合装置GM-8000を用いて、5%酸素濃度の虚血状態を作りだした。72 hpfのゼブラフィッシュを上記の条件で、60分および120分処理し、そこからmRNAを抽出して定量qPCRを行ったところ、別のstudyで虚血遺伝子として得られた遺伝子の発現が、虚血依存的に上昇することが確認された。
今後は、虚血状態でHB-EGFの発現を見ることができれば、エンハンサー同定への足がかりとなることが期待される。
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