| 研究概要 |
剖検ヒトアルツハイマー脳組織よりmRNAを抽出した後,逆転写cDNAを用いてShort-isoform ABCG4特異的プライマー、PCR法にて新規Short-isoform ABCG4 cDNAを作製した.pcDNA3.1発現ベクターヘサブクローニングしたShort-isoform ABCG4コンストラクトおよびFRAG, Myc, Hisタグ付加コンストラクトをそれぞれ作成した。さらに作製したヒトShort-isoform ABCG4コンストラクトを基にATP結合領域K108Mに変異導入したATP-mutant (mut)-ABCG4遺伝子をsite-directed mutagenesis法を用いて作製しヒトpcDNA3.1/Short-isoform mut-ABCG4コンストラクトも同様に作製した.
COS7,ヒトglioblastoma細胞を用いて、作製したShort-isoform ABCG4遺伝子をリポフェクション法にて一過性遺伝子導入および過剰発現恒常株をそれぞれ確立し,Short-isoform ABCG4の遺伝子導入細胞のウェスタンブロット解析の結果、細胞膜分画に認められると同時に培養上清に認められことから,このShort-isoform ABCG4は可溶型と考えられた.放射線ラベル(^3H)コレステロールを用い、1-20μg/ml ApoE (E2、E3、E4)、1-20μg/ml ApoA-I,1-50μg/ml HDL存在下にて、可溶性ABCG4遺伝子の哺乳細胞におけるApoA-I, ApoEおよびHDL依存性のcholesterol effluxへの関与を検討した.その結果,可溶型ABCG4は,HDL依存性cholesterol effluxを抑制した.可溶型ABCG4は,full-length ABCG4の持つHDL依存性efflux機能と競合し抑制した.
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