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腎糸球体ポドサイトの分化および糸球体硬化症の発症におけるFoxc1、Foxc2転写因子の役割を明らかにするために、各種ノックアウトマウス(KO)の導入と作製を試みようとしている。Foxc1 KOおよびポドサイト特異的Foxc1 KOを作製するため、Foxc1 flox/+マウスを海外共同研究者である米国Northwestern大学の久米博士の元から輸入した。このマウスはBlack Swiss系統により維持されているので、つがいで輸入し、f1世代を確保した後に帝王切開による清浄化を試みている。清浄化が済み次第、我々が所有するCAG-CreマウスまたはNephrin-Creマウスとの交配を開始する。Foxc2 KOも久米博士の元より同時に輸入したが、このKOもBlack Swiss系統により維持されている。f1の胎仔数が少なく、再度交配を繰り返し、清浄化を開始する準備をしている。
Foxc1およびFoxc2の下流で働く因子を同定するため、培養ポドサイトにこれらの転写因子を過剰発現させる系とノックダウンする系を作製した。全翻訳領域を含むFoxc1およびFoxc2のcDNAを単離し、pCAGGS発現ベクターに導入した。Foxc1およびFoxc2に対するmiRNAを設計し、ノックダウン用ベクターに導入した。293細胞にFoxc1、Foxc2それぞれの発現ベクターとノックダウンベクターを共発現させ、最も効率の良い配列を持つノックダウンベクターを選別した。これらのベクターを培養ポドサイトで発現させ、遺伝子発現解析用マイクロアレイによる解析を行う。
各KOマウスのポドサイトにおけるFoxc1とFoxc2の発現量を調べるために、In situハイブリダイゼーションの系を立ち上げた。組織切片上での検出が可能となり、これらの転写因子が成体のポドサイトに発現していることを確認した。
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