| 研究概要 |
本年度は,MAK-V/Hunkの遠位尿細管細胞でのAT1受容体系およびNa再吸収系に対する抑制機序の解析をおこなった
まず,通常型のMAK-V/Hunk発現ベクターに加えて,アデノウイルス発現ベクターを用いて高効率MAK-V/Hunk発現ベクターの作製した.また,内在性MAK-V/Hunk遺伝子発現をノックダウンさせるsiRNA-MAK-V/Hunkの配列決定をおこなった.そして、MAK-V/Hunkの局所発現解析実験においてMAK-V/Hunkの内在性発現が認められた細胞のうち,特に高発現が認められた遠位尿細管細胞の腎細胞培養系において,wild type MAK-V/Hunkを過剰発現,およびsiRNA-MAK-V/Hunkを遺伝子導入することにより細胞内でのMAK-V/Hunk発現を増加あるいは減少させて,AT1受容体発現量への影響や同受容体との結合性を調べるともに,同受容体下流の情報伝達系活性を解析して,MAK-V/Hunkによる具体的なAT1受容体抑制機序について検討した.また,同時に細胞免疫染色法,蛋白質リン酸化酵素活性測定,epithelial Na(+) channel (ENaC)やNa(+)-Cl(-) cotransporter (NCC)などのNa(+) transporter活性および発現解析(mRNA,蛋白),パッチクランプ法によるNa(+) current測定などを行い,細胞培養液へのNa(+)負荷刺激,アンジオテンシンII刺激,あるいは生体での圧負荷を細胞レベルでsimulateする周期的伸展刺激が遠位尿細管細胞に与える影響に対するMAK-V/Hunkの作用について検討を加えた
連携研究者横浜市立大学・医学部・准教授田村功一(HUNK発現解析を担当)
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