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(1)ヒトfu11-length USP40cDNAをサブクローニングし、ほ乳類用ベクターに挿入後、human embryonic kidney cellを用いて、ヒトUSP40安定発現株化細胞を作成した。
(2)USP40抗体の作成
ヒトと齧歯類に共通するアミノ酸配列を認識する特異抗体の作成を試みた。ヒト腎cDNAライブラリーからヒトUSP40のアミノ酸756-901に相当する部分のcDNAをサブクローニングし、大腸菌発現ベクターに挿入した後、大腸菌にて産生させたリコンビナントタンパクを作成した。これを抗原とした精製ラビットポリクローナル抗体を作成した。
(3)USP40mRNAの各臓器発現の網羅的解析
(2)の抗体の特異性を、(1)のUSP40安定発現株化を用いた免疫蛍光染色とwestern blotで蛋白の発現を確認した。USP40の細胞内局在は細胞質にびまん性に観察され、その分子量は~150kDaであった。次にこの抗体を用いて、マウス各臓器に置けるUSP40の局在を検討した。USP40は肺、脳、肝臓、心筋において、毛細血管と小動脈の内皮細胞の細胞質に観察された。特に腎臓においては、糸球体内皮に強く発現し、間質部位の血管における発現は弱く観察された。
(4)糸球体発生期におけるUSP40の発現
日齢12のマウス胎児腎を用いた検討から、USP40は間質血管およびS期糸球体の侵入血管において既に観察された。
(5)USP40の細胞内結合因子の同定
Full-lengh USP40とヒト腎ライブラリーを用いたyeast two-hybridスクリーンを行ったが、baitであるUSP40の発現が弱く、陽性データは得られなかった。
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