| 研究課題/領域番号 |
22591232
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
落合 豊子 日本大学, 医学部, 教授 (40133425)
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| 研究分担者 |
鈴木 良弘 日本大学, 医学部, 助教 (80206549)
羅 智靖 日本大学, 医学部, 教授 (60230851)
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| キーワード | アスピリン / マスト細胞 / CRACチャネル / siRNA / Ca^<2+>チャネル |
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| 研究概要 |
1)Ca_V1.2LTCCSノックダウン細胞を用いたマスト細胞に対するアスピリンの作用の解析
マスト細胞に対するアスピリンの増強効果にはCa_V1.2LTCCSが関与することを明らかにするため、Ca_V1.2LTCCSのノックダウン細胞を作製し、アスピリンの作用の解析を試みた。
RBL-2H3細胞にて、siRNAを用いたCa_V1.2LTCCSのノックダウン細胞の作製は既に成功し、アスピリンによる細胞内カルシウムの流入に対する関与はみとめられている。しかし、未処理のコントロール細胞と比べ、脱穎粒やロイコトリエン産生に有意な差がみられなかったため、Ca_V1.2LTCCSとCRACチャネルの両方のノックダウン細胞の作製を試みた。まず、CRACのノックダウン細胞を作製するため、siRNA処理してCRACを構成する分子であるSTIM1とORAIIのノックダウン細胞を作製し、FACSを用いてSTIM1、ORAI1の発現を測定したが、未処理のコントロール細胞とノックダウン細胞では、有意な差は認めなかった。
2)CRACチャネルノックダウン細胞を用いたマスト細胞に対するアスピリンの作用の解析
上記のようにSTIM1とORAI1をsiRNAを用いてノックダウン細胞を作製し、CRACチャネル刺激薬であるタブシガギンによる細胞内カルシウム流入の測定、人為的SOCEの測定、脱穎粒反応の測定を行ったが、いずれも有意な差は認めなった。これは、実験条件が最適でなく、ノックダウンが十分になされていない可能性、もしくは、ORAI1とSTIM1のノックダウンはされているものの、他のカルシウムチャネルや他の分子が代償的に働くために、結果としては差が出ない可能性などが考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
STIM1とORAI1のノックダウン細胞の作製が成功しないため、アスピリンの増強効果に対する影響を検討出来ない。これは、siRNAの濃度や処理時間などの最適な条件が合わないため、もしくは、分子レベルではノックダウンができていたとしても、他のカルシウムチャネルが代償的に働き、機能的には差が表れないため、等の理由が考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノックダウン細胞の作製が成功しないため、siRNAの導入効率を向上させる条件を検討する。ノックダウン細胞の作製が成功した場合には、細胞内カルシウムの流入、脱顆粒、ロイコトリエンの産生を測定する。ノックダウン細胞の作製が成功しない場合には、ORAIは1～3のサブタイプがRBLで確認されており、STIMは1,2のサブタイプがあることが知られているため、全てのサブタイプを網羅するノックダウンの作製を試みる予定である。
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