| 研究課題/領域番号 |
22591437
|
|---|
| 研究機関 | 熊本大学 |
|---|
研究代表者 |
尾崎 宣之 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (40551255)
|
|---|
| 研究分担者 |
高森 啓史 熊本大学, 大学院・生命科学研究部, 講師 (90363514)
近本 亮 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (10419640)
馬場 秀夫 熊本大学, 大学院・生命科学研究部, 教授 (20240905)
石河 隆敏 熊本大学, 大学院・生命科学研究部, 特任講師 (00343351)
|
|---|
| キーワード | PSTI / SPINK1 / 膵癌 / 大腸癌 |
|---|
| 研究概要 |
1.siRNAを用いたSPINK1 Knockdomの実験
今回の実験はColo205にて行った。SPINK1 siRNAはin vitrogenより購入。siRNAをリポフェクタミンを用いてトランスフェクションし、48時間後に細胞回収。RT-PCRにてノックダウンされていることを確認した。細胞数は有意に減少した。CAG-SPINK1minigeneによる過剰発現系。mini-geneをリポフェクタミンにて細胞に導入した。SPINK1の発現が上昇していることをRT-PCRにて確認し、細胞数は有意に増加した。この実験系からもSPINK1は細胞増殖促進活性に関与していることが示唆された。
2.PSTIに特異的に結合するタンパクの同定
既にヒトPSTIに対する抗体を作製し、同抗体を使用し、Dynabeads Protein GビーズにAnti-PSTI抗体を結合させ、上記のPSTIを添加した細胞株のライセートと反応させる。Anti-PSTI抗体-PSTI蛋白-未知タンパク複合体を抽出する。なおこのDynabeadsという磁気ビーズを用いることで、backgroundが非常に低くなるとされている。上記工程で得られたタンパクを液体クロマトグラフ・質量分析計(LC-MS)を用いて網羅的に解析した。この工程においてbackgroundが解析の妨げとなり(Keratin等)上記backgroundを少しでも減少させるため、Anti-PSTI抗体-PSTI蛋白-未知タンパク複合体をZOOM IEF FractionatorにてpH別にフラクショネーションし、得られたタンパクを銀染色でさらにフラクショネーションした。Development and differentiation-enhancing factor 2、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F precursor等の新規タンパクを抽出することができた。
|
