|
口腔常在菌や歯周病菌などの病原菌の腸管上皮への影響を解析するために、マウス小腸上皮細胞の培養法の確立、特にαディフェンシンを分泌するパネト細胞の株化を目標とした。マウス上皮細胞の初代培養：CD１マウス胎生17日から小腸組織を採取後、培地 (DMEM-10%FBS)で37℃、5％CO2で培養して得られた初代細胞群は線維芽細胞などの間葉系細胞と共に上皮細胞形態を示す細胞も多く含まれた。しかし、細胞内に顆粒を持つパネト細胞の形態を示す上皮細胞は観察できなかった。そこで、次にオルガノイド培養を試みた。小腸オルガノイド培養：マウス CD1から小腸組織を採取し、縦切開、絨毛除去、EDTA処理後、陰窩部位を組織より分離した。分離した陰窩をマトリゲルに包埋し、EGF、Noggin、R-spondin1を含む無血清培地で37℃、５％CO2で培養した。培養1日目には陰窩は円状を示し、培養4日目には管腔状で陰窩領域と絨毛領域をもつ小腸オルガノイドに成長した。その後、成長オルガノイドは7日毎に継代を行い2ヶ月以上の長期培養が可能だった。パネトの細胞同定：オルガノイドの陰窩領域先端部には顆粒を細胞内に持つ細胞が多く見られた。この細胞内に顆粒を保持する細胞がパネト細胞かを知るために、パネト細胞顆粒に特異的に存在するクリプチンを免疫染色にて検出を試みた。結果、顆粒内は染色されオルガノイド陰窩部にパネト細胞が存在していることが示された。以上、本研究により得られたオルガノイド・パネト細胞を用いることで様々な菌種との相互間関係を解析できる可能性が示された。
|
