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2010 年度 実績報告書

顎下腺細胞におけるIP3産生の時空間パターンの蛍光分子センサーによる解析

研究課題

研究課題/領域番号 22592073
研究機関北海道医療大学

研究代表者

東城 庸介  北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731)

研究分担者 谷村 明彦  北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (70217149)
根津 顕弘  北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
森田 貴雄  北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
キーワード唾液腺 / 顎下腺 / イノシトール三リン酸 / LIBRA / IP_3 / Ca^<2+> / イメージング
研究概要

1. 作製済みであるLIBRAvIIs(IP_3結合ドメインの両端にECFPとVenus遺伝子を融合)を細胞質発現型に改変するため、LIBRAvIIsの膜結合ドメインを除き、さらにタンパク質精製用Histidin-tagをLIBRAvIIsのcDNAに導入し、細胞質発現型LIBRAvIIs(cLIBRAvIIs)ウイルスベクターを作製した。作製したウイルスベクターをHEK293細胞に感染させ、増殖後、培地中に放出したウイルス粒子を採取した。
2. ウイルスベクターをCOS-7細胞に感染させ、細胞からcLIBRAvIIsを抽出後、Talonビーズを用いて精製した。様々な濃度のIP_3を付加し、精製cLIBRAvIIsの蛍光比の変化をマイクロプレートリーダーを使って調べた。IP_3は30nMから30μMの濃度で用量依存的にcLIBRAvIIsの蛍光比を上昇させた。この結果は、精製cLIBRAvIIsがIP_3に対する感受性を保持していることを示している。さらに精製cLIBRAvIIsを単離耳下腺細胞にin vitroで導入し、反応性を確認した。
3. 麻酔下のラットの開口部からアデノウイルス粒子を注入し、2日後に顎下腺を摘出して蛍光を観察した。ウイルスを注入した顎下腺組織でcLIBRAvIIsの蛍光が観察されたが、舌下腺では観察されなかった。
4. 単離した顎下腺細胞のcLIBRAvIIs蛍光は主に腺房細胞の細胞質に発現していた。100μMアセチルコリンで刺激し、蛍光比の変化を測定したが、有意な変化は観察できなかった。現在、細胞の調製法、測定法などの改良を試みている。

  • 研究成果

    (1件)

すべて 2011

すべて 学会発表 (1件)

  • [学会発表] 細胞質発現型IP_3バイオセンサーの分離精製と耳下腺腺房細胞への導入2011

    • 著者名/発表者名
      根津顕弘
    • 学会等名
      第84回日本薬理学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2011-03-23

URL: 

公開日: 2012-07-19  

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