| 研究課題/領域番号 |
22592073
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
東城 庸介 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731)
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| 研究分担者 |
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (70217149)
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
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| キーワード | 唾液腺 / 顎下腺 / イノシトール三リン酸 / LIBRA / IP_3 / Ca^<2+> / イメージング |
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| 研究概要 |
1. 作製済みであるLIBRAvIIs(IP_3結合ドメインの両端にECFPとVenus遺伝子を融合)を細胞質発現型に改変するため、LIBRAvIIsの膜結合ドメインを除き、さらにタンパク質精製用Histidin-tagをLIBRAvIIsのcDNAに導入し、細胞質発現型LIBRAvIIs(cLIBRAvIIs)ウイルスベクターを作製した。作製したウイルスベクターをHEK293細胞に感染させ、増殖後、培地中に放出したウイルス粒子を採取した。
2. ウイルスベクターをCOS-7細胞に感染させ、細胞からcLIBRAvIIsを抽出後、Talonビーズを用いて精製した。様々な濃度のIP_3を付加し、精製cLIBRAvIIsの蛍光比の変化をマイクロプレートリーダーを使って調べた。IP_3は30nMから30μMの濃度で用量依存的にcLIBRAvIIsの蛍光比を上昇させた。この結果は、精製cLIBRAvIIsがIP_3に対する感受性を保持していることを示している。さらに精製cLIBRAvIIsを単離耳下腺細胞にin vitroで導入し、反応性を確認した。
3. 麻酔下のラットの開口部からアデノウイルス粒子を注入し、2日後に顎下腺を摘出して蛍光を観察した。ウイルスを注入した顎下腺組織でcLIBRAvIIsの蛍光が観察されたが、舌下腺では観察されなかった。
4. 単離した顎下腺細胞のcLIBRAvIIs蛍光は主に腺房細胞の細胞質に発現していた。100μMアセチルコリンで刺激し、蛍光比の変化を測定したが、有意な変化は観察できなかった。現在、細胞の調製法、測定法などの改良を試みている。
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