| 研究課題/領域番号 |
22592200
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
金指 幹元 鶴見大学, 歯学部, 助教 (80339811)
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| 研究分担者 |
片桐 岳信 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (80245802)
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| キーワード | 移植・再生医療 / 再生医学 / 細胞・組織 / 生理活性 / 歯学 / 歯周組織再生材料 / 臍帯由来間葉系細胞 / BMP-2 |
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| 研究概要 |
鶴見大学歯学部倫理審査委員会の審査と承認(510号)のもと、連携医療機関で書面にて同意の得られた被験者より臍帯の提供を受け研究を行った。本研究の目的はヒト臍帯動・静脈周囲に存在する未分化間葉系細胞を用いた次世代の組織工学的歯周組織再生材料を開発するための基礎データを得ることである。
今年度の臍帯由来間葉系細胞は、より多くのpericyte集団を得るため、臍帯動・静脈周囲に付着しているCollagenase Type Iを用いて37℃で18～24時間酵素消化コラゲナーゼ処理し、可能な限りWharton's jellyを取り除きそのままカルチャーフラスコに静置しoutgrowthした細胞を得る方法(vessel explant)で得られた細胞を用いた。
さらに今年度は、臍帯細胞の優位性を検証するためコントロール細胞として、歯根膜由来細胞(倫理審査委員会承認309号)、ヒト骨髄由来葉系細胞(市販品)を用いた。
上記3つの細胞の3～4継代細胞についてpericyteのマーカーであるCD146陽性細胞を得るためミルテニーバイオテク株式会社細胞分離カラムおよび標識抗体を用いて陽性細胞、陰性細胞に分けた。
生理活性であるBMP-2、FGF-2および硬組織誘導培地(デキサメタゾン、βグリセロリンサン、アスコルビン酸)で分化誘導を行い形成されるNoduleをアリザリン染色することで硬組織形成能をスクリーニング評価した。しかしながら、一般に間葉系幹細胞は接着性の細胞として生体各組織から採取するので、単一の細胞種ではなく複数の種類の細胞から構成されるため、歯根膜細胞、骨髄細胞に比べ臍帯由来細胞の硬組織形成能(染色性)は低い傾向を示した。また同一細胞間でも染色性に違いが認められた。現在RT-PCR法にてCol1,BSP1,Cbfa1,OC,ALP,CD146の遺伝子発現を調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
H23年3月11日に発生した東日本大震災に伴う鶴見大学の停電により、培養機器、冷凍庫、冷蔵庫などの電化製品が使用できず、特に培養中の細胞は全滅した。このため新たに初代細胞を得なければならず、計画がやや遅れている(足場材料とのハイブリッド体の作製および実験動物への移植が遅れている)。
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| 今後の研究の推進方策 |
一般に間葉系幹細胞は接着性の細胞として生体各組織から採取するため、単一の細胞種ではなく複数の種類の細胞から構成される。近年、ヒト間葉系組織、間葉系培養細胞において多分化能を有するが腫瘍性を持たないMuse細胞が東北大学大学院医学系研究科細胞組織学分野出澤真理教授の研究グループより報告された(Kuroda.Y,et al:PNAS,2010/Wakao.S,et al:PNAS,2011)そこで本研究に用いる臍帯よりSSEA-3、CD105二重陽性細胞をFACSにて分離した後に、多能性マーカーを発現したclusterが浮遊培養で形成されることで得られる臍帯由来Muse細胞を分離、培養することで"幹細胞の濃縮"を加える。また今年度は、連携研究者として産業技術総合研究所健康工学健康部門組織・再生工学研究グループ弓場俊輔研究グループ長よりin vitro硬組織形成能の分析について技術移転を予定している。
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