| 研究概要 |
本研究は,粘液産生に関係する遺伝子MUC1の口腔粘膜における発現機構の解明と細菌感染防御との関係を明らかにすることを目的としており,本年度は,MUC1遺伝子のクローニング,遺伝子導入によりMUC1を強制発現させた細胞の作製を以下のとおり実施した。
1.MUC1遺伝子のクローニングは,C57BL/6Jマウスの小腸組織からゲノムDNAを抽出して行った。抽出したゲノムDNAを制限酵素で部分分解し,パルスフィールド電気泳動により,ゲノムDNA断片の分離精製を行った。SmaI,BamHI,NotI等で切断後,パルスフィールドを行ったが,適度な断片化の制限酵素が無く,現在も反応条件を含めた検討を行っている。
2.ヒトMUC1遺伝子の入手
実験計画段階では検索できなかったが,OriGene社のcDNAクローンコレクション中にヒトMUC1cDNAが存在することが確認できたので,TrueORF(MUC1)の購入を行った。これはMyc-DDKタグを持つpCMV6-ENTRYベクターにMUC1遺伝子がオープンリーディングフレームとして挿入されており,動物細胞への遺伝子導入,タンパク発現が容易に行える。
3.MUC1遺伝子を強制発現させた細胞の作製は,購入したTrueORF(MUC1)を用いて行った。
HeLa細胞に対してエレクトロポレーションによりpCMV6-ENTRYプラスミドの導入を行い,Myc-DDK抗体でMUC1タンパク発現の確認を行った。現在のところ,導入細胞の作製に成功しておらず,導入方法の検討を行っている。
|
