| 研究概要 |
本研究は,粘液産生に関係する遺伝子MUC1の口腔粘膜における発現機構の解明と細菌感染防御との関係を明らかにすることを目的としており,本年度は,ヒトMUC1遺伝子を導入した細胞の作製ならびにその細胞を用いた細胞障害性実験の検討を以下のとおり実施した。
1.遺伝子導入細胞の作製
pCMV6-MUC1を遺伝子導入用カチオン性脂質Lipofectamineを用いてHeLa細胞,Raw細胞に遺伝子導入を行った。コントロール用に空ベクターであるpCMV6-Entry vectorの導入も行った。トランジェントトランスフェクションと同時に,ステーブルトランスフェクションも行い,遺伝子安定発現株の確立も試みた。安定株については現在も確立を続行中である。
2.遺伝子発現の確認
トランジェント遺伝子導入細胞からRNAを採取し,MUC1特異的primerとプラスミドベクター特異的primerを用いたPCRにより,導入遺伝子の確認を分子生物学的に行った。さらに,蛋白質レベルでの発現確認のために,プラスミドベクターのタグであるDDKに対するanti-DDK monoclonal antibodyを使用してwestern blottingを行った。
3.感染ならびに細胞傷害性実験
歯周病原性細菌の産生する毒素を用いた細胞障害性実験のために,遺伝子組換え大腸菌からrecombinant CDT(cytolethal distending toxin)を精製分離した。現在,トランジェントトランスフェクション細胞を用いて細胞傷害性実験を行っており,アッセイ系の至適条件の検討ならびにCDT濃度の検討を続行している。HeLa細胞については細胞傷害性の基本結果を今までに確立しているが,Raw細胞に関しては基本的な細胞解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒトMUC1遺伝子の哺乳動物細胞への導入に手間取っているため,実験全体の進捗状況に遅れが出ている。実験の安定かつ信頼のおける結果を得るために,遺伝子安定発現株を作製しているが,多種の導入方法の試行ならびに遺伝子量の検討を行っているが,安定株の作製結果が出るにはほぼ1ヶ月程度の時間がかかるため,実験の遅れとなっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ステーブルトランスフェンクション株の確立に努力をしつつ,トランジェントトランスフェンクション株を用いた実験を行う。結果の信頼度をあげるために,通常より実験回数を多くしてトランジェントトランスフェンクション株を用いた実験を行う。MUC1遺伝子はHeLa細胞ならびにRaw細胞が保有しているおり,過剰発現状況においてこの遺伝子の感染防御機能を検討するために遺伝子導入を行っている。場合によっては遺伝子破壊または欠損株の作製が必要となるかもしれない。
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