研究課題
基盤研究(C)
ヒトう蝕細菌であるStreptococcus mutans およびStreptococcus sobrinusを標的とした生菌・死菌の区別が可能な定量検出系を開発・評価した。最初に、S. mutans およびS. sobrinusに特異的な遺伝子領域を検索し、その領域よりS. mutans およびS. sobrinusの特異プライマーを設計した。次に、そのプライマーの特異性を評価するため、各種口腔細菌の染色体DNAを精製、鋳型DNAとして設計したプライマーを用いたPCR法による特異性の評価を行った。次に、オートクレーブで加熱殺菌を行った死菌を生菌に加えたものおよび死菌非添加のサンプルについて、PCR阻害剤であるプロピジウムモノアザイド(PMA)を添加し、これら両群間におけるPCRによるDNA増幅に違いがみられないことを確認した。次に、唾液・歯垢に前述の死菌を加え、PMAで処理し、遺伝子増幅に差がみられないことを確認した。以上のことから、PMA はPCRにおいて死菌特異的に遺伝子増幅の阻害を行い、生菌特異的に遺伝子増幅を行うことおよび歯垢・唾液等の臨床検体中でもPCRによる増幅阻害が起こらないことが明らかになった。また、同じくPCR阻害剤であるエチジウムモノアザイド(EMA)を用いたところ、生菌への為害性があることが明らかになったこと、PMA添加/非添加のS. mutans およびS. sobrinusを寒天培地に培養して、用いた濃度でPMAが同菌の生死に影響を与えないことが明らかになりPMAを使用することの優位性が確認された。また。これらの結果から、PMAは口腔内細菌の生死を区別した検出に応用可能であることが明らかになった。そこで、この系を用いてう蝕のない患者の歯垢と唾液中のS. mutansあるいはS. sobrinusの生菌数の相関を調べたところ、相関がみられたが、う蝕病巣である軟化象牙質と唾液の同菌の生菌数の相関を調べたところ、相関が認められなかった。以上の事から、う蝕の病巣の生菌数は唾液には反映されないことが明らかになった。
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