| 研究課題/領域番号 |
22603016
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
木村 忠史 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (60344214)
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| 研究分担者 |
久保 泰 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (10178030)
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| キーワード | タランチュラ / 毒腺 / cDNAライブラリー / 次世代シーケンス / トランスクリプトーム / 生理活性ペプチド |
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| 研究概要 |
毒産生生物の毒液は、進化生態学でいう軍拡競争に基づく加速進化により様々なペプチド性毒が含まれているケミカルライブラリーと考えることができる。我々はこれまでに南米産タランチュラ毒腺のcDNAライブラリーを構築、約9000個のクローンを得、そのうち約900個のクローンのDNA配列を決定し30個以上の新規生理活性ペプチドを発見している。
今年度の研究計画では、更に約2000個のクローンの解析を進めることを目標とした。約9000個のクローンの制限酵素切断パターンを解析したデータを元に、先に決定した約900個のクローンとはできるだけパターンの異なるクローンを選択しPCRによりインサートを増幅、DNA配列を決定した。約700個のクローンの配列を決定したところで雇用していた実験補助者が体調不良により辞職したためcDNAライブラリーの解析を中断した。そこで毒腺で発現しているmRNAの次世代シーケンサーによる網羅的解析をblastXによるアノテーション解析も含めて外注することとし、毒腺の総RNAを抽出し解析受託会社へ提供した。平成23年3月下旬にGS FLX Titanium Chemistryによる次世代シーケンシング解析によるデータを元にしたblastX解析結果を得たところである。今回の解析ではランダムプライム法による均一化全長cDNAライブラリーを解析対象として総解析塩基数156Mbのシーケンシングを行った。MIRA Assembler Version 2.9.45xlを用いたアセンブル解析では、1Kb以上かつ5read以上で定義されるLarge Contigが867個得られている。現在、詳細な解析を進めているところである。
平行してペプチド遺伝子を枯草菌Brevibacillus発現系用のpNCMO2およびpNY326ベクターに組み込みBrevibacillusでのペプチド発現の検討を行った。強力なプロモーターを用いたベクターpNCMO2に組み込んだ場合、細胞毒性が高いためか細胞増殖が悪く、またペプチドの発現も認められなかった。弱いプロモーターを用いたベクターpNY326に組込むと一部のペプチドの発現を確認することができた。
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