| 研究概要 |
超高齢化社会を迎え、完全房室ブロックや洞機能不全症候群などの徐脈性不整脈に罹患する患者は増加の一途をたどっている。そこで新たな治療戦略として、心臓ペースメーカー細胞に特異的に発現する転写因子を固有心筋細胞に遺伝子導入し、固有心筋細胞をペースメーカー細胞へと直接再プログラミングし、人工的なバイオペースメーカー細胞を作成することを試みた。
まず50匹のC57BL6マウスから洞房結節を切除し、total RNAを採取した。これをテンプレートとしてssDNAを作成し、アジレント社のマイクロアレイを使用して遺伝子の発現プロファイルを右心房筋と比較した。その結果、洞房結節で発現量の高い転写因子28種、低い転写因子16種を同定した。このうち特に発現量の高いもの5種類(X,shox2,Isl1,Tbx3,Tbx18)のC端に蛍光蛋白質を融合したcDNAを作成した。これをアデノウイルスベクターにより培養心筋に遺伝子導入し,洞房結節のマーカー遺伝子であるHcn4の発現量変化を測定した。逆に洞房結節で発現量の低いNkx2.5およびNRSFに関しては、siRNAの遺伝子導入により遺伝子ノックダウンを行った。その結果、NRSFのノックダウンに加えてShox2もしくは転写因子Xを過剰発現した場合のみ、Hcn4の発現量が増加した。
遺伝子ノックダウンについてはoff-target効果を除外するために、NRSFコンディショナルノックアウトマウスを入手し、現在実験を継続中である。予備実験では上記の結果を支持するデータが得られている。さらに大規模かつ高効率のスクリーニングを実施するために、Hcn4遺伝子座へluciferase cDNAをノックインしたマウスを作成中である。このマウスを使って繊維芽細胞などからも再プログラミングを実施し、プレートリーダーを使ってHcn4発現細胞をスクリーニングする予定である。
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