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本研究では、葉緑体型ATP合成酵素γサブユニットのチオールスイッチ部分の配列を、光駆動スイッチタンパク質であるフォトトロピンのLOVドメイン、光合成細菌のBLUFドメイン、シアノバクテリアのGAFドメインにそれぞれ置き換え、光のオンオフあるいは波長の切り替えによって酵素活性および回転が調節出来るかどうかを調べることを目指した。まず、制御領域に光応答タンパク質のスイッチ部分を遺伝子操作によって導入し、新たな制御機能を付加することを試みた。対象としたのは、既に構造が解析されている光駆動スイッチタンパク質であるフォトトロピンのLOVドメイン、光合成細菌のBLUFドメイン、およびシアノバクテリアのGAFドメインである。本年度は、BLUFドメインについて、ATP合成酵素のγサブユニットのチオールスイッチ部分との置き換えを試みたが、いずれの場合にもγサブユニット単独、複合体いずれにおいても融合タンパク質を得ることができなかった。このため、γサブユニットをこれらのスイッチドメインを導入する部分で切断したタンパク質として発現させるための遺伝子を作成し、複合体形成の可否を調べている。
ATP合成酵素の加水分解活性の測定に一般に用いられるピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素を共役させ、NADHの酸化によってモニターするカップリングアッセイ法の感度を向上させることを目的として、連携研究者の竹内昌治准教授(東大・生産技術研)の協力を得て少量の溶液小胞中(オイル中の水玉)に封じ込めた酵素の動態を簡便にモニターできる実験系の開発を実施した。カップリングアッセイにシステムを応用するために、まず一段階で蛍光変化の起こる酵素系としてグルコース6リン酸脱水素酵素の実験系を確立し、その酸化還元応答を微少小胞中で観察できる実験系を確立した。
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