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老化や代謝に関わる制御因子として注目されているNAD^+依存性脱アセチル化酵素Sirtuinファミリーの研究が近年急激な広がりを見せており、老化、代謝や概日時計の分子基盤を理解するためには、1細胞内でのNAD^+動態の時空間情報を知ることが重要になってくる。しかし従来のNAD^+分析法では、細胞を破壊して組織抽出液中のNAD^+を測定するため、個々の細胞の持つ時空間情報が失われてしまう。そこで本研究では、Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET)法により細胞内NAD^+を可視化するためのFRETプローブ開発を行った。PRETプローブとして、中央にヒトSIRT1由来NAD^+結合ポケット、N端にYFP (yellow fluorescent protein)、C端にCFP (cyan fluorescent protein)を持つ1分子FRETを作製した。作成したFRETプローブを培養細胞に導入したのち、異なる作用機序により細胞内NAD^+量を減少させることが知られているH_2O_2とFK866をそれぞれ培養細胞に処理し、FRET現象の有無を蛍光分光光度計を用いて評価した。その結果、どちらの処理によってもFRET現象を起こしていることを示すプローブを見出した。これらの結果は、このFRETプローブが細胞内NAD^+量を感知していることを示唆している。次年度は、FRETプローブ精製標品を用いて、試験管内でNAD^+および類似代謝物(NADH、ニコチンアミドなど)に対するFRETプローブの特異性を検証し、NAD^+特異的プローブを完成させる。
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