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本年度は以下の3点を中心に実施し、次年度計画の遂行に重要な成果を得た。
1.アミノアシル-tRNA合成酵素遺伝子のクローニング
メチオニル-tRNA合成酵素(MetRS)遺伝子をカイコ絹糸腺由来のトータルRNAからPCR増幅し、そのアミノ酸配列を決定した。また、5'および3'RACE解析によりカイコMetRSの全長cDNA配列を明らかにした。
2.改変型アミノアシル-tRNA合成酵素遺伝子の作出
クローニングしたカイコMetRSについて、他生物種由来の同種酵素との配列比較からアミノ酸結合ポケットを構成する残基を推測した。アミノ酸の識別に重要と推測された残基(Leu264)に対し、その側鎖が小さくなるようなアミノ酸置換(Leu264→Gly)を導入することで、改変型MetRS遺伝子を作出した。
3.改変型アミノアシル-tRNA合成酵素によるアミノ酸アナログのin vitroアッセイ
野性型および3種(Thr407→Ala;Thr407→Gly;Ala450→Gly)の改変型フェニルアラニル-tRNA合成酵素(PheRS)を大腸菌で発現させ、6×Hisタグによるアフィニティ精製を行った。調製した組換え酵素のin vitroにおけるアミノアシル化活性を、電気泳動を用いる定性評価法によりアッセイした。その結果、改変型PheRSが有するアミノ酸置換の種類によって、パラ位に置換基を有するフェニルアラニン類縁体の認識様式が変化することを見出した。また、野性型および改変型MetRSを大腸菌で発現させるためのベクターを作製した。
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