HBV pseudotypeによる感染性を指標にしたHBV感染受容体の同定戦略

2011 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22659091
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 上田 啓次 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00221797)
• 研究分担者: 中野 和司 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00521725) ; 大崎 恵理子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (50447801)
• キーワード: B型肝炎ウイルス / pseudotype / 感染受容体

研究概要

本申請ではHBV pseudotypeの作製に成功し、感染性を指標にした新たなアッセイ系を用いてウイルス学上の最大の難問に挑んだ。
I)HBV pseudotype(HBV 膜粒子を被ったgfp遺伝子を含むレトロウイルスゲノムをもつpseudotypeウイルス;HBV-p)の作製に向けたパッケージング細胞とHBVp産生系の確立.
a)パッケージング細胞の樹立.レトロウイルスゲノム産生ベクター(HyTc-gfp)及びgag-pol発現ベクター(gp)を培養細胞株へトランスフェクションしgfp及びハイグロマイシン耐性遺伝子(hygR)をもつレトロウイルスゲノムを産生するパッケージング細胞を樹立した。
b)パッケージング細胞の活性の検討.a)で作製したパッケージング細胞でVSV-G pseudotypeの作製を試みパッケージング細胞として活性をもつかどうかを検討した-すなわち、本細胞へVSV-G発現ベクターをトランスフェクションし、培養上清中に出現したVSV-G pseudotypeを全く別の培養細胞株への感染性を検討した。
c)HBV-p産生能の検討.本パッケージング細胞へHBV粒子膜蛋白遺伝子発現ベクターをトランスフェクションし、分泌されるウイルス粒子をPEG沈殿法、超遠心法、抗HBs抗体を用いた免疫沈降法などで回収し、粒子内ゲノム(RNA)を抽出する。RT-PCR法による粒子内ゲノムgfpを標的としたRT-PCR法で検討した。
d)HBV-p産生効率の検討.GFP産生を指標にトランスフェクション効率を評価し、トランスフェクションの最適化を図りつつ、産生量を定量PCR法で検討した。
II)HBV-pを用いた感染性を指標にしたHBV感染受容体のスクリーニング.レトロウイルスcDNAライブラリーをHBV-pにより、スクリーニングしたが、結果的にはまだ感染受容体の候補因子は見つかっていない。しかしながら、本実験過程で、肝癌由来培養細胞株に非活性型の受容体の存在が示唆される結果を得た。

研究成果

• [雑誌論文] B型肝炎のウイルス学 (2012)
  • 著者名/発表者名: 上田啓次
  • 雑誌名: 化学療法の領域 巻: (印刷中)
• [雑誌論文] Overexpression of HGF attenuates the degeneration of Purkinje cells and Bergmann glia in a knockin mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (2012)
  • 著者名/発表者名: Noma, S., Ohya-Shimada, W., Kanai, M., Ueda, K., Nakamura, T., Funakoshi, H.
  • 雑誌名: Neuroscience Res 巻: (in press)
  • DOI: 10.1016/j.neures.2012.03.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel Monoclonal Antibodies for Identification of Multicentric Castleman's Disease ; Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Encoded vMIP-I and vMIP-II (2012)
  • 著者名/発表者名: Nakano, K., Katano, H., Tadagaki, K., Sato, Y., Ohsaki, E., Mori, Y., Yamanishi, K., Ueda, K.
  • 雑誌名: Virology 巻: 425 ページ: 95-102
  • DOI: 10.1016/j.virol.2012.01.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Genome Replication, Partition and Maintenance in the Latency (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohsaki, E., Ueda, K.
  • 雑誌名: Frontiers in Virology 巻: 3 ページ: 1-12
  • DOI: doi:10.3389/fmicb.2012.00007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of Kaposi's sarcoma-associated virus-associated lymphomas by DNA array analysis (2011)
  • 著者名/発表者名: Ueda, K., Ohsaki, E., Nakano, K., Zheng, X.
  • 雑誌名: Leukemia Research and Treatment 巻: 2011 ページ: 1-12
  • DOI: doi:10.4061/2011/726964
  • 査読あり
• [図書] Herpesviridae-A Look into This Unique Family of Viruses (2012)
  • 著者名/発表者名: Ueda, K., Ito, E., Karayama, M., Ohsaki, E., Nakano, K., Watanabe, S.
  • 出版者: In-Tech(in press)